逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Rt-LAMP)技術(shù)檢測仙臺病毒的方法建立與應(yīng)用.pdf

1、仙臺病毒(Sendaivirus，SeV)屬于副粘病毒科副粘病毒屬，是一個單股負鏈RNA病毒，小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等嚙齒類實驗動物均易感。仙臺病毒傳染性強、易擴散，一般呈隱性感染，是嚙齒類實驗動物最難控制的病毒之一，鼠群感染仙臺病毒后會改變體內(nèi)細胞免疫反應(yīng)，干擾試驗結(jié)果，因此建立快速診斷方法十分必要。為了在實驗動物微生物質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域使診斷仙臺病毒的檢測更為特異、敏感、快速，本研究旨在利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)構(gòu)建出

2、仙臺病毒的檢測方法，并通過初期臨床實驗驗證了檢測方法的可靠性，為仙臺病毒在實驗動物種群中的凈化和控制提供相應(yīng)的支持手段。
　　 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)技術(shù)檢測仙臺病毒的方法構(gòu)建主要包括如下幾個步驟:引物設(shè)計與篩選;體系優(yōu)化;試劑配置;特異性、靈敏性及符合性實驗。引物設(shè)計方面本研究從在NCBI下載仙臺病毒(GI:9627219)全基因組，選擇較為保守的融合蛋白(FusionProtein，F(xiàn)P)基因作為靶基因，與多

3、種突變株FP基因進行比對，確定高度保守序列即靶序列，并設(shè)計出三套引物。并通過LAMP標準試劑盒篩選出最理想的一套;從病毒增殖液中提取病毒RNA作為模板，采用實時濁度儀對鎂離子，dNTPs、Betaine、內(nèi)外引物等影響因子的用量以及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間做出了篩選，從而對整個體系進行了優(yōu)化，并將根據(jù)優(yōu)化結(jié)果裝配了反應(yīng)試劑;在體系靈敏性實驗中，對病毒模板進行梯度倍比稀釋后，SeVRT-LAMP最低可以檢測到10-5梯度，最低檢出限為0.95p

4、g，是SeVRT-PCR檢測靈敏度的30倍;在特異性實驗中，SeVRT-LAMP僅檢測出仙臺病毒，并通過酶切反應(yīng)證實其特異性擴增，其他如CDV等病原微生物的檢出率為0;在符合性實驗中，SeVRT-LAMP法檢測結(jié)果與上海實驗動物質(zhì)量監(jiān)督站采用ELISA方法檢測的結(jié)果陽性符合率達到100％;
　　 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)技術(shù)檢測仙臺病毒的初步應(yīng)用主要包括如下兩個步驟:人工攻毒回歸實驗和臨床應(yīng)用。人工攻毒回歸實驗中，

5、無論是血清樣本還是肺組織樣本，SeVRT-LAMP檢測法的陽性檢出率為100％;臨床應(yīng)用中，采用病毒分離、RT-PCR及RT-LAMP三種方法同時對50份待檢樣本進行仙臺病毒檢測。其中，病毒分離法檢測出陽性8份，陽性感染率16％;RT-PCR檢測出陽性9份，陽性感染率18％;RT-LAMP檢測出陽性11份，陽性感染率22％。其中，病毒分離法檢測為陽性的，RT-LAMP法檢測均為陽性，RT-PCR檢測出其中的7份;病毒分離為陰性的，RT-

6、LAMP檢測出其中3份為陽性;RT-PCR檢測為陽性的，RT-LAMP法檢測均為陽性;有兩份樣品僅有RT-LAMP法檢測為陽性，SeVRT-LAMP與病毒分離法的陽性符合率為100％，SeVRT-PCR與病毒分離法的陽性符合率為87.5％，具體匯總在表。與上海實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢疫站的檢測結(jié)果對照，RT-PCR與RT-LAMP有差異的2份樣本中，有1份樣本ELISA檢測為可疑，1份樣本檢測為陽性。綜合計算，SeVRT-LAMP與SeVRT

7、-PCR的一致率為92％。值得一提的是，臨床應(yīng)用中的SeVRT-LAMP檢測體系加入了鈣黃綠素顯色劑作為指示，反應(yīng)結(jié)束后可直接用肉眼進行判斷。
　　 本研究所構(gòu)建的SeVRT-LAMP檢測方法快速靈敏，操作便捷、判定簡單，為SeVRT-LAMP試劑盒的研制打下了良好的基礎(chǔ)。如果設(shè)計出環(huán)引物，并優(yōu)化鈣黃綠素顯色劑中錳離子與鈣黃綠素的比例，可以進一步提升擴增效率，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用?？傊啾饶壳皬V泛使用的血清學檢測法，Se