Ad35腺病毒載體構(gòu)建及病毒蛋白免疫原性研究.pdf

1、目前以C組5型腺病毒(Ad5)載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的腺病毒載體在基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用,但是由于其轉(zhuǎn)導(dǎo)作用依賴于細(xì)胞表面的柯薩奇-腺病毒受體(CAR),許多重要的細(xì)胞如造血干細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面Ad5吸附受體CAR表達(dá)很少,一些惡性腫瘤細(xì)胞CAR的表達(dá)比相應(yīng)的正常組織細(xì)胞要少,Ad5載體難以轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因；同時(shí)正常人群Ad35的感染率在90％左右,體內(nèi)預(yù)存的中和抗體可迅速清除腺病毒載體,導(dǎo)致治療基因消失。這些問題限制了5型腺病毒(Ad

2、5)載體的廣泛應(yīng)用。為此人們?cè)谠噲D利用其他型別的腺病毒開發(fā)新型載體,以克服這些不足。
　　 35型腺病毒(Ad35)以幾乎在所有的人類體細(xì)胞表面都有表達(dá)的CD46作為吸附受體,可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不易被Ad5感染造血細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞。而且世界范圍內(nèi)正常人群中Ad35感染率不到5％,病毒載體被抗體清除的概率小,所以Ad35腺病毒作為頗具吸引力的基因治療載體近年來(lái)受到人們的青睞。但目前Ad35載體尚未商品化,且迄今為止僅有

3、的幾例有關(guān)成功構(gòu)建Ad35載體一般采用體外連接法,載體構(gòu)建過(guò)程繁瑣,病毒包裝成功率低。有鑒于此,本文擬利用體外同源重組方法來(lái)構(gòu)建Ad35載體包裝系統(tǒng),以期建立一種操作簡(jiǎn)便的Ad35載體系統(tǒng)。
　　 為了評(píng)價(jià)Ad35載體在實(shí)際應(yīng)用中的可行性,為構(gòu)建Ad35載體提供可靠的理論依據(jù),本文首先對(duì)人6個(gè)組10種不同型腺病毒基因組序列同源性進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)人群普遍感染的C組Ad5腺病毒與人群感染率很低的B組Ad35腺病毒在進(jìn)化上親緣關(guān)系比較

4、遠(yuǎn),六鄰體蛋白氨基酸同源性比較顯示Ad5和Ad35六鄰體的同源性只有75.3％,這提示Ad5和Ad35六鄰體之間存在交叉反應(yīng)的可能性比較?。恢髮?duì)中國(guó)1157份0-80歲健康人群進(jìn)行了Ad4、Ad5和Ad35抗體水平的本底篩查,結(jié)果顯示在中國(guó)正常人群感染Ad4和Ad5的比例分別為70％和90％左右,而Ad35的感染要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Ad4和Ad5,只有不到5％。
　　 根據(jù)細(xì)菌內(nèi)同源重組的原理,克隆了Ad35的全基因組DNA,構(gòu)建了病毒

5、包裝所需的穿梭質(zhì)粒、骨架質(zhì)粒和表達(dá)Ad35腺病毒E1B的細(xì)胞系293-E1B,并通過(guò)同源重組的方法成功在293-E1B細(xì)胞系中包裝出復(fù)制缺陷型的Ad35腺病毒,病毒的包裝滴度達(dá)到106TCID50/ml,接近于野生型腺病毒。同時(shí)還對(duì)影響病毒包裝效率的pXI蛋白進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)pXI蛋白是影響重組病毒包裝效率的主要因素。
　　 目前對(duì)Ad35的基因組編碼產(chǎn)物研究的還很少,為了闡明Ad35基因組編碼產(chǎn)物中與誘導(dǎo)體液免疫有關(guān)的蛋白