狂犬病病毒G蛋白的原核表達(dá)和免疫原性分析.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)引起的，是世界上最致命的傳染病之一，死亡率接近100％?？袢《臼强袢《緦?Lyssavirus genus)，彈狀病毒科（Rhabdoviridae family）的一種單股負(fù)鏈RNA病毒，可引起人類，家畜及野生動物急性腦膜炎而導(dǎo)致死亡，并可在大多數(shù)哺乳動物中廣泛傳播?？袢≈饕峭ㄟ^被狂犬病毒感染的動物的撕咬、抓撓受傷而傳播。在中國，狂犬病的主要傳播來源是被

2、RABV感染的狗和貓等。當(dāng)前，對于狂犬病感染或發(fā)病后的治療方法尚未實現(xiàn)，因而及時接種狂犬病疫苗可在很大程度上有效防制狂犬病。目前我國動物用狂犬病疫苗主要是傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗，弱毒疫苗存在返毒的危險，而滅活疫苗則存在滅活不徹底的風(fēng)險?；蚬こ虂唵挝灰呙缬捎诓缓袕?qiáng)毒的感染性組分，所以不必進(jìn)行滅活措施，是新型疫苗研究的重要發(fā)展方向。
　　G(glycoprotein)蛋白是狂犬病毒的五種組成蛋白之一，由524個氨基酸組成，蛋白分子

3、質(zhì)量約為62KD。G蛋白是狂犬病毒中唯一糖基化的，以及唯一可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白。因此，G蛋白既是狂犬病毒中最有效的保護(hù)性抗原，同時也是研究基因工程亞單位疫苗的首選抗原，是狂犬病基因工程亞單位疫苗研究的熱點。
　　本課題研究中，利用狂犬病病毒CTN-1V10株為模板，以生物工程合成的方法合成編碼G蛋白的基因片段G。將該片段插入大腸桿菌pET-28a載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，構(gòu)建完成后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL2

4、1(DE3)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE電泳及Western blot結(jié)果表明，重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中實現(xiàn)了大量可溶性表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對該蛋白的反應(yīng)原性和免疫原性進(jìn)行了研究與分析。
　　首先以狂犬病病毒CTN-1V10株(Genebank: AEV43285)為模板，設(shè)計相應(yīng)的特異性引物，以生物工程合成的方法合成編碼G蛋白的基因片段G，片段大小為1884bp。PCR結(jié)果表明，合成的目的片段長度正確。隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化，連接等步

5、驟將目的片段與大腸桿菌pET-28a載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。
　　然后對重組蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性的菌株命名為pET-G。提取重組成功的質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，經(jīng)菌液PCR，酶切，測序鑒定，三種鑒定均成功后，方可用于后續(xù)的蛋白表達(dá)試驗中。分別從溫度、誘導(dǎo)時間梯度、誘導(dǎo)劑三個方面入手，對G蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行逐步優(yōu)化。SDS-

6、PAGE電泳檢測，以及Western blot鑒定結(jié)果表明，在20℃，IPTG濃度為0.2 mM，誘導(dǎo)時長為12h時，重組蛋白的可溶性表達(dá)量最高。且蛋白可與抗RABV單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。
　　接下來進(jìn)行了重組蛋白的純化條件摸索。利用Ni填料親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法對重組G蛋白進(jìn)行純化，以獲得相對純度較高的目的蛋白，并檢測蛋白活性，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。
　　最后進(jìn)行了小鼠免疫試驗及G蛋

7、白的免疫原性分析。將30只6周齡的BALB/c小鼠按照免疫原的區(qū)別分為6組，分別為Tris buffer組(NC)，商品滅活苗免疫組(PC)，G-BI-Tris組，G-BI-ISA組，G-BB-Tris組，G-BB-ISA組。其中BI，BB為免疫增強(qiáng)劑，ISA為佐劑。按照剪耳編號，剪尾，采血，背部皮下多點注射的順序免疫小鼠，每只小鼠注射100μL。28天后進(jìn)行二免，至56天為止，期間每周采血一次，獲得血清后-40℃凍存?zhèn)溆谩?6天后取2