兩株狂犬病病毒糖蛋白的桿狀病毒表達及其免疫原性研究.pdf

1、狂犬病是指由狂犬病病毒(rabies virus,RV)感染動物機體而引起的一種以腦脊髓炎為主要病理特征,以神經(jīng)癥狀為主要臨床表現(xiàn)的人獸共患傳染病。古埃及時代該傳染病就已經(jīng)開始流行,直到2012年,全球范圍內(nèi)仍有90多個國家或地區(qū)發(fā)生狂犬病。近十年來,全球每年約有50,000至60,000人死于該病。在我國,每年患狂犬病死亡人數(shù)多達2000~3000人。雖然近些年來偶有關于人狂犬病治愈的報道,但現(xiàn)在仍然沒有有效的治療規(guī)程和相關藥物,所以

2、一旦狂犬病病毒感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,死亡率仍幾乎為100％。因此,目前防控狂犬病的策略仍然是以預防為主,接種疫苗是其中最為有效的方法。這不僅是因為人暴露狂犬病后及時接種狂犬疫苗能使自身產(chǎn)生抗體,從而有效預防狂犬病的發(fā)生,更重要的是如果在狂犬病的中間宿主群體中進行了高覆蓋率(70%)的免疫接種,則可切斷狂犬病病毒在中間宿主群體間的傳播,從而為徹底消滅狂犬病提供可能。
　　現(xiàn)在,市面上的人或動物狂犬疫苗大都為滅活疫苗。但滅活苗成本較高,

3、對于經(jīng)濟欠發(fā)達國家來說不是有效控制、消滅狂犬病的理想選擇。亞單位疫苗屬于基因工程疫苗的一種,價格一般相對低廉,且不像重組活載體疫苗那樣涉及活載體病毒等生物安全因素,相對安全,易得到相關部門審批,現(xiàn)已有多種亞單位疫苗得到臨床應用。因此,亞單位疫苗有望作為新型狂犬疫苗的重點發(fā)展方向之一。
　　本研究以探索狂犬病亞單位疫苗研制為目的,開展了如下試驗:
　　1.狂犬病病毒糖蛋白基因重組桿狀病毒的構建。試驗內(nèi)容:
　?、倏袢〔?/p>

4、毒街毒株BD06及疫苗株SRV9糖蛋白基因的RT-PCR擴增獲取。
　?、趯煞N糖蛋白基因分別克隆入Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)所提供的供體質(zhì)粒(pFastBacI)中,酶切鑒定正確后,轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細胞,待重組供體質(zhì)粒與其中穿梭質(zhì)粒(含有桿狀病毒全基因組的質(zhì)粒,Bacmid)發(fā)生定向轉(zhuǎn)座后,挑取白色單菌落,提取重組穿梭質(zhì)粒后,以M13通用引物對重組穿梭質(zhì)粒進行PCR鑒定,之后選取構建正確克隆。
　　③

5、以鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞,拯救重組桿狀病毒,并通過電鏡觀察等方法對其進行形態(tài)學鑒定。
　　④以免疫熒光、SDS-PAGE及western blot等方法鑒定重組桿狀病毒是否成功表達狂犬病病毒糖蛋白。
　　2.重組桿狀病毒表達的狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性試驗。試驗內(nèi)容:
　?、賰煞N粗制狂犬病病毒糖蛋白以高、低兩個梯度的劑量分別免疫小鼠。
　?、诿庖吆?4d及28d分別對免疫小鼠進行尾靜脈采血并分離血清

6、,以熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)方法測定血清中狂犬病病毒中和抗體水平。
　?、勖庖吆?5d,以100LD50狂犬標準攻擊毒(CVS-24)對所有免疫組小鼠進行腦內(nèi)攻毒試驗。
　?、芄ザ竞竺咳沼^察,記錄小鼠死亡狀況,統(tǒng)計試驗結(jié)果,分析兩種糖蛋白免疫效果,評價其免疫原性并比較兩種糖蛋白的免疫原性是否具有差異。
　　通過上述試驗,獲得以下試驗結(jié)果:
　　1.成功擴增出SRV9株與BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因,將其

7、克隆至供體質(zhì)粒后,經(jīng)酶切鑒定,獲得正確構建的重組供體質(zhì)粒。PCR鑒定結(jié)果顯示成功獲得分別含有SRV9株與BD06株狂犬病病毒糖蛋白基因的重組穿梭質(zhì)粒。電鏡觀察轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)細胞病變的細胞培養(yǎng)物,可觀察到具有明顯桿狀病毒形態(tài)的病毒顆粒。對接種第三代重組桿狀病毒病變的Sf9細胞進行SDS-PAGE及wesern blot鑒定,結(jié)果顯示在接近72kDa大小處出現(xiàn)蛋白條帶,野生型桿狀病毒感染細胞在相應位置未出現(xiàn)類似蛋白條帶。對接種第三代重組桿狀病毒

8、的Sf9細胞以狂犬病病毒糖蛋白熒光單抗進行熒光抗體染色,熒光顯微鏡下可觀察到特異性綠色熒光,野生型桿狀病毒感染昆蟲細胞經(jīng)同樣處理后熒光顯微鏡下沒有觀察到特異性綠色熒光。
　　2.重組桿狀病毒表達的狂犬病病毒糖蛋白小鼠免疫結(jié)果顯示,SRV9株糖蛋白與BD06株糖蛋白在高劑量水平時,均可誘導100%的小鼠發(fā)生血清陽轉(zhuǎn),整體抗體水平分別能達到13.5IU/ml和3.42IU/ml,并能提供100%的針對致死劑量狂犬病病毒的攻毒保護;但在

9、低劑量水平時,SRV9株糖蛋白僅能夠誘導部分小鼠發(fā)生陽轉(zhuǎn),整體抗體水平接近于0,且不能為小鼠提供任何保護,而BD06株糖蛋白依然可以誘導100%小鼠發(fā)生陽轉(zhuǎn)(整體抗體水平依然可以達到5.92IU/ml)并能為其提供80%的保護率。經(jīng)統(tǒng)計學分析,在兩種狂犬病病毒糖蛋白在誘導小鼠產(chǎn)生抗體水平及發(fā)生陽轉(zhuǎn)率方面差異均極為顯著(p<0.01)。
　　通過以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:
　　1.獲得兩株能夠分別表達狂犬病病毒SRV9株與BD0

10、6株糖蛋白的重組桿狀病毒。重組桿狀病毒所表達出的兩種糖蛋白均具有免疫原性,能夠作為狂犬病亞單位疫苗研制的候選抗原。
　　2.BD06株糖蛋白的免疫原性要顯著高于SRV9株糖蛋白,這表明前者更適合用于亞單位疫苗的研制。
　　3.不同毒株糖蛋白免疫原性存在顯著性差異表明進一步篩選免疫原性更高的糖蛋白具有重要意義,且篩選范圍不必局限于狂犬病病毒疫苗株。
　　論文創(chuàng)新點:
　　1.通過研究桿狀病毒表達系統(tǒng)所表達出的狂犬病