昆蟲桿狀病毒表達(dá)的狂犬病毒G蛋白間接ELISA檢測方法的研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的重要的人獸共患病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，人和動物一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100％。野生動物是本病的主要天然儲存宿主，犬是人狂犬病的最主要傳染源。近年來該病在我國的發(fā)生呈逐年上升的趨勢，已成為嚴(yán)重危害我國公共衛(wèi)生的重大疫病。 隨著動物國際貿(mào)易需求的增加，為控制全球日益嚴(yán)峻的狂犬病疫情，國家與國家之間對于進(jìn)出境口岸的犬、貓等動物也要進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫監(jiān)管，要求動物必須接種狂犬病疫苗，并且中和抗體效價(jià)

2、要高于國際標(biāo)準(zhǔn)(0.5 IU/ml)才允許其進(jìn)出境。因此世界衛(wèi)生組織和國際獸疫局(OIE)把這一國際單位(0.5 IU/ml)作為疫苗免疫后血清中和抗體效價(jià)的最低標(biāo)準(zhǔn)。但是由于各國的疫苗種類、質(zhì)量、工藝、所用的佐劑以及免疫時(shí)間、次數(shù)不同，即使已經(jīng)免疫的動物也存在著中和抗體的差異，因此急需建立一種更加快速的方法來檢測免疫動物的中和抗體水平。 現(xiàn)有的狂犬病中和試驗(yàn)操作繁瑣，需時(shí)較長，要求條件高，不適宜口岸快速檢測的需求，因此急需建立

3、一種與進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫相適應(yīng)的快速、敏感、特異的方法來代替中和試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法因其敏感、特異、快速，因而在進(jìn)出境口岸動物疫病檢驗(yàn)檢疫中得到了廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)外已有報(bào)道用ELISA方法可以檢測狂犬病毒抗體，但是針對狂犬病毒中和抗體檢測方法的研究未見報(bào)道。 本研究利用已純化的狂犬病毒糖蛋白作為包被抗原，通過條件優(yōu)化，建立了間接ELISA方法，并用該方法對狂犬病疫苗免疫后不同時(shí)期血清中的中和抗體進(jìn)行檢測。 條件優(yōu)化后

4、，間接ELISA方法各項(xiàng)反應(yīng)參數(shù)如下：抗原包被量為0.3μg/ml；包被條件為37℃，2h后4℃過夜；血清的最佳稀釋倍數(shù)為40倍；HRP-兔抗犬IgG的最佳工作濃度為1：2000；最佳封閉液采用1％濃度的卵清蛋白；封閉條件為37℃，2h；血清樣品的稀釋液選用1％濃度的卵清蛋白；酶標(biāo)抗體的稀釋液也選用1％濃度的卵清蛋白。待檢血清，酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為1h，底物反應(yīng)的時(shí)間為10min。陰陽臨界值確定為0.252。 之后，利用OIE

5、指定的檢測狂犬病毒中和抗體的方法，即熒光抗體病毒中和試驗(yàn)與ELISA進(jìn)行對比，分別利用兩種方法對疫苗免疫后不同時(shí)期的376份犬血清進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)檢測，有299份為陽性，77份為陰性，而用間接ELISA方法檢測，有282份為陽性，94份為陰性。間接ELISA方法的特異性為100％，敏感性為94.31％，與熒光抗體病毒中和試驗(yàn)結(jié)果的符合率為95.48％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，兩種方法的差異不顯著，從而進(jìn)一步證實(shí)建立的