狂犬病病毒中和抗體ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化.pdf

1、在中國，由狂犬病病毒引起人間狂犬病的死亡人數(shù)一直位居37種法定公開傳染病前列。其中，大多數(shù)案例與犬只咬傷相關(guān)。因此，確保犬只對(duì)狂犬病病毒的防御能力是切斷其向人間傳播的重要手段。目前，公認(rèn)的量化犬只狂犬病病毒抵抗能力的方法是測(cè)定犬血液中中和抗體的水平。但中和試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高且需要使用狂犬病病毒強(qiáng)毒株，而目前市面上的商品化試劑盒檢出的為狂犬病全病毒抗體。因而檢測(cè)狂犬病病毒的中和抗體難以普及。
　　本研究的目的是完善一套準(zhǔn)確而又便捷

2、的狂犬病病毒中和抗體ELISA試劑盒。首先，確定表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白優(yōu)勢(shì)抗原RV G3的工程菌能高效表達(dá)。用IPTG誘導(dǎo)4h后，收集菌體。重懸并在低溫環(huán)境下超聲破碎菌體，收集包涵體沉淀。然后，通過8 mol/L尿素的溶解液溶解包涵體。過純化柱獲得高度純化的RV G3蛋白，以該蛋白為抗原包被反應(yīng)板，建立狂犬病病毒中和抗體間接ELISA方法。
　　經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定RV G3蛋白的最佳包被濃度是163μg/mL；最佳包被條件為37℃1.

3、5 h；最適的封閉劑是無蛋白封閉液；最佳封閉時(shí)間為1 h；血清最佳稀釋度是1:10；最佳血清孵育時(shí)間是1.5 h；最佳血清稀釋液為0.5％的脫脂乳；酶標(biāo)二抗最適濃度為1:1000；最佳酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為1 h；底物液反應(yīng)時(shí)間為15 min；讀數(shù)波長為450 nm。
　　此外，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明批內(nèi)和批間重復(fù)性的變異系數(shù)均小于10%。敏感性實(shí)驗(yàn)表明敏感度為1:160。利用此方法檢測(cè)22份犬血清樣品，計(jì)算的中和抗體滴度結(jié)果分別與商品化EL