狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引發(fā)的人獸共患病，其發(fā)病后死亡率高達(dá)100％。目前沒有有效治療狂犬病的方法，所以狂犬病的診斷十分重要。RABV有5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中糖蛋白（G）是唯一暴露在病毒表面的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。本研究旨在制備出G蛋白單克隆抗體，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行初步探索。
　　1、G蛋白單克隆抗體的制備：
　　本研究首先用純化的狂犬病病毒SAD株的全病毒蛋白（RABV全蛋白）免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，

2、三次免疫后用構(gòu)建的真核質(zhì)粒pcDNA3.1-G進(jìn)行加強(qiáng)免疫，待小鼠血清中G蛋白抗體水平達(dá)到要求后，進(jìn)行PEG法細(xì)胞融合。經(jīng)過(guò)間接ELISA法和間接免疫熒光法（IFA）篩選雜交瘤細(xì)胞后，獲得4株G蛋白單克隆抗體，分別命名為6C3、6D1、6D12、6F3。其中6C3株為中和性抗體，滴度為53.3 IU/mL；用間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清，效價(jià)分別為28、210、28、29，腹水效價(jià)分別為106、106、105、105；用小鼠抗體亞

3、類鑒定試劑盒測(cè)得抗體亞型均為IgG2a（κ）；用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)得抗體親和常數(shù)分別為5.2×108、1.7×108、6.1×107、5.0×108；用Western-blot法測(cè)得4株單抗與犬副流感病毒、犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒均無(wú)交叉反應(yīng)；用IFA法測(cè)得4株單抗可以識(shí)別RABV固定毒株（LBNSE、B2c和CVS-11）和野毒株（DRV-AH-08和DRV-SX-15）；用辛酸-硫酸銨沉淀法分別從腹水中純化4株單抗，SDS-PAGE

4、檢測(cè)可見高純度輕鏈（25 KD）和重鏈（50 KD）；BCA法測(cè)定4株抗體濃度分別是1.79 mg/mL、1.52 mg/mL、1.03 mg/mL和1.34 mg/mL。
　　2、G蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用：
　　將6C3株進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記，即 HRP-G，濃度為1.0 mg/mL，標(biāo)記率為47%。間接ELISA工作濃度為2.0μg/mL；Western-blot工作濃度為0.25μg/mL。經(jīng)過(guò)配對(duì)試驗(yàn)測(cè)

5、得包被抗體為6F3，其包被濃度為3.35μg/mL，包被條件為4℃過(guò)夜；封閉液為5%脫脂奶粉，封閉條件為37℃孵育2 h；抗原反應(yīng)條件為37℃孵育1 h；檢測(cè)抗體為HRP-G，工作濃度為5.0μg/mL，工作條件為37℃孵育1 h；底物反應(yīng)時(shí)間為15 min。
　　綜上所述，本研究篩選到能穩(wěn)定分泌抗RABV G蛋白的單克隆抗體4株，其中6C3株為中和抗體，將其進(jìn)行HRP標(biāo)記，并進(jìn)行了雙抗夾心ELISA方法建立的初步探究，為狂犬病毒