抗狂犬病病毒單克隆抗體的制備及初步研究.pdf

1、狂犬病是一種重要的世界性人獸共患傳染病，據(jù)衛(wèi)生組織報告，全球每年報告5.5萬例人狂犬病，該病病程進展迅速，一旦發(fā)病，100％死亡，而且全世界該病治愈病例極少，因此對該病的準確快速、特異性的診斷方法和有效的疫苗的研究顯得尤為重要。
　　 1978年Wiktor報道狂犬病病毒單克隆抗體的制備，此后，狂犬病病毒單克隆抗體在狂犬病的診斷和免疫學分析中得到了廣泛的應用，并有望在狂犬病暴露后預防中替代免疫球蛋白發(fā)揮作用。WHO推薦的用于狂犬

2、病病原學實驗室診斷的金標準免疫熒光(DFA)以及評價狂犬病病毒(RV)中和抗體的快速免疫熒光灶抑制試驗(RFFIT)已經(jīng)廣泛應用于國內(nèi)外。這兩種檢測方法均需要抗RV核蛋白(NP)熒光標記抗體，而RV在細胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量較低，不易從RV顆粒獲得大量純化的NP，目前這種檢測試劑在國內(nèi)尚沒有獲得批準文號和商業(yè)途徑可以獲得，而進口產(chǎn)品價格昂貴，因此限制了這兩種檢測方法在國內(nèi)的普遍應用和標準化。鑒于這種情況，此類研究的開展，將非常有助于發(fā)展我國具有

3、自主知識產(chǎn)權的狂犬病實驗室檢測和診斷用試劑，提高我國狂犬病監(jiān)測能力。
　　 本實驗分為三部分內(nèi)容，包括狂犬病病毒單克隆抗體的制備鑒定，單克隆抗體的標記以及標記單抗的初步應用。
　　 本實驗室采用人用狂犬病疫苗PV株、桿狀病毒表達的RV核蛋白以及狂犬病病毒野毒株HN10，作抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法進行融合;利用間接免疫熒光法篩選雜交瘤細胞后，經(jīng)克隆后建株，獲得特異穩(wěn)

4、定分泌抗狂犬病病毒單克隆抗體細胞株，并將此細胞株經(jīng)小鼠腹腔注射制備單抗腹水;然后進行了抗體亞類、特異性和敏感性以及蛋白免疫印記等的系統(tǒng)鑒定，利用SPA親和層析的方法進行腹水純化，通過常規(guī)方法對所得單抗進行辣根過氧化物酶（HRP）和異硫氰酸熒光素(FITC)標記，確定FITC標記抗體的工作濃度后對實驗室現(xiàn)存的部分標本進行了檢測，設置Millipore公司的標記單抗為陽性對照，對兩者的檢測結(jié)果進行了分析比較。
　　 每次融合，融合率

5、達到80％以上，融合后，立即將融合細胞液稀釋到15-20塊融合板，經(jīng)過陸續(xù)三批的檢測，1-2次的亞克隆，最終獲得3株（3B12、4A12和5B8）特異穩(wěn)定分泌抗狂犬病病毒單抗細胞株，前兩者腹水效價分別為1∶8000，1∶10000。
　　 由于5B8獲得比較晚，后續(xù)工作針對前兩株單抗進行，經(jīng)鑒定，單抗亞類型為抗狂犬病病毒IgG2a亞類;經(jīng)Western-blot鑒定兩株單抗細胞株能高效價穩(wěn)定特異分泌抗狂犬病病毒核蛋白單抗，且具有