豬瘟病毒單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever，CSF)曾被稱為豬霍亂(Hog cholera，HC)，俗稱“爛腸瘟”，是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。研究表明，CSFV單克隆抗體不僅能為CSFV免疫機(jī)理等研究提供幫助，還使開(kāi)發(fā)新型CSFV強(qiáng)弱毒的鑒別檢測(cè)以及CSFV同種屬病毒的鑒別檢測(cè)技術(shù)成為可能，因此，制備更高特異性及靈敏度的CSFV單克隆抗體

2、意義重大。
　　本研究首先根據(jù)CSFV石門(mén)株在PK-15細(xì)胞上的增殖規(guī)律，對(duì)CSFV石門(mén)株進(jìn)行大量繁殖，并建立了穩(wěn)定性較高的CSFV檢測(cè)方法;隨后依次使用離心過(guò)濾、膜包超濾濃縮、Sepharose4Fast Flow過(guò)濾層析(4FF-SEC)等方法對(duì)CSFV進(jìn)行純化。分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)、免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)等對(duì)病毒純化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果證明病毒純化成功，并確定過(guò)濾層析后的

3、第一個(gè)收集峰為純化的CSFV;經(jīng)IPMA測(cè)定病毒原液、超濾濃縮液、4FF-SCE純化病毒液的TCID50結(jié)果顯示，經(jīng)超濾濃縮后，CSFV的TCID50/mL由最初的1047提升至106.5，病毒回收率約76.52％，超濾濃縮液經(jīng)4FF-SEC進(jìn)一步純化后，最終病毒回收率為63.2％。用上述純化的CSFV作為免疫原免疫6～8周齡BALB/c小鼠，隨后用大腸桿菌表達(dá)純化的CSFV E0-E2融合蛋白作為包被原，通過(guò)間接ELISA測(cè)定免疫小鼠

4、效價(jià)，免疫效價(jià)最高可達(dá)到1∶25600。
　　選取免疫效價(jià)較高的3號(hào)小鼠，取其脾臟與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合;經(jīng)ELISA方法篩選、2～3次亞克隆篩選、Western Blot鑒定后獲得5株可以與CSFV E0-E2融合蛋白特異性結(jié)合的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為:5F2A7、5F2C12、8D4G7、9A1C7、11D4B6。IPMA結(jié)果顯示，5株抗體均與病毒結(jié)合，其中，9A1C7與病毒結(jié)合能力最強(qiáng)，且不與牛病毒性腹瀉病毒(

5、Bovine viral disease virus，BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、PCV2(Porcine circovirus type2,PCV2)發(fā)生反應(yīng)。經(jīng)鑒定，9A1C7具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體的能力;單抗亞型為IgG2c，輕鏈κ型。將9A1C7雜交瘤細(xì)胞株接種小鼠腹腔制備腹水，通過(guò)正辛酸-硫酸銨法對(duì)收集