抗卡那霉素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素的一種，其被廣泛添加到動(dòng)物飼料中，以防止動(dòng)物機(jī)體受到細(xì)菌的感染。但是不遵守休藥期規(guī)定及不合理的用藥等情況，都會(huì)造成卡那霉素在動(dòng)物組織中的殘留。如果人類長(zhǎng)期攝取含有卡那霉素殘留的食品，將會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的耳毒性或腎毒性損害。所以建立ELISA檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)卡那霉素在動(dòng)物源性食品中的殘留是十分必要的。制備卡那霉素完全抗原及抗卡那霉素單克隆抗體是ELISA檢測(cè)方法建立的核心步驟，直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的敏感性及準(zhǔn)確度。

2、
　　本實(shí)驗(yàn)分析了卡那霉素的結(jié)構(gòu)特性及免疫學(xué)特性，用兩種方法制備了卡那霉素人工抗原，并對(duì)制備結(jié)果進(jìn)行了鑒定;用雜交瘤技術(shù)制備了抗卡那霉素單克隆抗體，并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。以上工作為動(dòng)物源性食品中卡那霉素殘留的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法建立奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容具體如下:
　　1、卡那霉素人工抗原的制備及鑒定。
　　將卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備人工抗原。利用兩種不同的偶聯(lián)

3、方法:碳二亞胺法(EDC)和戊二醛法(GDA)，分別制備出KAN-BSA（作為免疫原），KAN-GDA-OVA（作為包被原）。利用SDS-PAGE凝膠電泳和動(dòng)物免疫試驗(yàn)，鑒定了完全抗原偶聯(lián)情況。結(jié)果顯示:偶聯(lián)物的蛋白條帶相比載體蛋白的條帶有明顯的滯后性;制備的卡那霉素完全抗原能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，且抗血清效價(jià)均達(dá)到1∶2.56×104，其中1號(hào)小鼠的IC50值為22.28ng/mL，說(shuō)明完全抗原免疫原性良好，抗原制備成功。

4、　　2、抗卡那霉素單克隆抗體的制備及鑒定。
　　利用細(xì)胞融合技術(shù)，將1號(hào)小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞NS0在PEG的作用下融合，制備雜交瘤細(xì)胞。利用間接ELISA及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法篩選陽(yáng)性克隆。選擇能穩(wěn)定傳代的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行克隆化，經(jīng)過(guò)三次亞克隆，得到2株能穩(wěn)定分泌抗卡那霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞——1E1、2B12，并將其擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存。
　　采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。用棋盤

5、法做間接ELISA試驗(yàn)，進(jìn)行最佳包被濃度的選擇，結(jié)果顯示包被原KAN-GDA-OVA的最佳工作濃度為2.5μg/mL。用最佳包被濃度包被酶標(biāo)板，采用間接EHSA及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法測(cè)定制備的抗卡那霉素單克隆抗體的效價(jià)及敏感性，并根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)1E1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到回歸方程y=-0.3793x+0.8084，IC50為6.5024ng/mL。
　　最后對(duì)所制備的抗卡那霉素單克隆抗體進(jìn)行一系列的特性鑒