抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w的制備以及鑒定.pdf

1、目的：巖沙?？舅兀≒TX）是目前已知毒性最強(qiáng)烈的海洋生物毒素之一，具有作用于神經(jīng)、肌肉的電壓門控鈉通道，改變通道的功能，以及對細(xì)胞毒性、溶血等多方面的影響。人類在進(jìn)食經(jīng)PTX污染的食物后，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肌肉疼痛、腰痛、排黑尿等癥狀，甚至死亡。而目前在我國乃至全球仍未研究出一種針對該毒素的治療藥物，因此PTX的存在對人類的健康安全構(gòu)成相當(dāng)大的威脅。 本課題通過化學(xué)方法制備出PTX的人工抗原，將其與弗氏佐劑混合后對BALB/c小鼠進(jìn)

2、行免疫，產(chǎn)生抗PTX抗血清，并以較為成熟的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，建立分泌巖沙?？舅氐母咛禺愋詥慰寺】贵w雜交瘤細(xì)胞株。該細(xì)胞株的建立為日后在實(shí)際工作中對PTX的檢測提供有利的工具。 方法：本課題分三部分進(jìn)行： 1．抗PTX的抗血清的制備 將PTX與載體蛋白KLH、BSA偶聯(lián)成具有免疫功能的PTX-PDP-KLH免疫抗原和PTX-PDP-BSA檢測抗原。用PTX-PDP-KLH免疫雌性6～8周齡BALB/c小鼠，采

3、用眼眶后靜脈叢取血獲得抗PTX抗血清，對其效價(jià)進(jìn)行間接ELISA法檢測，以健康BALB/c小鼠血清為對照組。 2．分泌抗巖沙?？舅豈cAb的雜交瘤制備 將能分泌出抗PTX抗血清的免疫小鼠脾臟細(xì)胞通過傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)與NS-1骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并通過間接ELISA方法篩選克隆陽性雜交瘤細(xì)胞株，陽性細(xì)胞對其擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。 3．抗巖沙?？舅貑慰寺】贵w的檢測及生產(chǎn) 將成功分泌抗PTX單克隆抗體的融合細(xì)胞

4、進(jìn)行核型分析、特異性分析后，注射進(jìn)健康BALB/c小鼠體內(nèi)，14天左右產(chǎn)生腹水。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、rProteinA親和層析等方法純化后得到腹水型抗體。 結(jié)果： 1．利用連續(xù)紫外分光光度計(jì)檢測出在267 nm時(shí)偶聯(lián)物PTX-PDP-KLH出現(xiàn)峰值，而PTX-PDP-BSA在273nm時(shí)出現(xiàn)峰值。將PTX-PDP-KLH對BALB/c小鼠進(jìn)行皮下、腹部多點(diǎn)免疫，以PTX-PDP-BSA作為檢測抗原進(jìn)行包被，對其抗血清

5、進(jìn)行ELISA檢測，所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射了免疫抗原的小鼠抗血清與對照組有明顯差別（1：2500時(shí)OD>7）。 2．雜交瘤細(xì)胞融合率為21．43％，其陽性克隆率為9．1％，經(jīng)過間接ELISA方法反復(fù)篩選，獲得能穩(wěn)定分泌抗PTX單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株A6和B8。 3．核型分析發(fā)現(xiàn)，抗PTX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目在94～104之間，特異性檢測中PTX與載體蛋白KLH、BSA沒有發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示該抗體為抗PTX的特異性

6、抗體。細(xì)胞免疫小鼠后產(chǎn)生4～5 ml的腹水，經(jīng)過分離純化后，SDS-PAGE分析表明，抗PTX單克隆抗體細(xì)胞株在50 kD和25 kD處各出現(xiàn)一條蛋白條帶，與IgG的重鏈和輕鏈的大小相符。 結(jié)論： 1．本研究通過化學(xué)方法成功將PTX和載體蛋白KLH、BSA偶聯(lián)，克服了PTX因分子量小而無法刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的因素，偶聯(lián)后的PTX-PDP-KLH具有免疫原性，從而誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PTX抗血清。 2．通過雜交瘤技術(shù)獲得A