抗TRPM2兔單克隆抗體制備及初步鑒定.pdf

1、背景：抗體從多克隆發(fā)展到單克隆抗體藥物，已被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)及醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)產(chǎn)品中。相比鼠單克隆抗體而言，兔單克隆抗體具有高親和力，特異性強(qiáng)，易于人源化等優(yōu)點(diǎn)。TRPM2(Transient receptor potential channels melastatin，瞬時(shí)受體電位通道M型2)是Ca2+非選擇性陽(yáng)離子通道，受ADPR(Adenosinediphosphate ribose，二磷酸腺苷核糖)和H2O2激活調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃

2、度，從而對(duì)細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能進(jìn)行調(diào)控，與能量代謝修復(fù)和氧化應(yīng)激相關(guān)的病理性疾病有關(guān)。目前市面上主要是TRPM2多克隆抗體，其特異性和親和力并不是十分理想。
　　目的：制備TRPM2兔單克隆抗體。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了三段TRPM2多肽，YCA-10987，YCA-10988和YCA-10989，每段多肽免疫三只實(shí)驗(yàn)兔。經(jīng)過(guò)血清blot實(shí)驗(yàn)初步篩選，將可能免疫了TRPM2兔脾細(xì)胞與240E兔骨髓瘤樣細(xì)胞株融合，產(chǎn)生能分泌

3、TRPM2抗體的兔-兔雜交瘤細(xì)胞，用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，運(yùn)用ELISA法和WB法，篩選獲得陽(yáng)性克隆，選取其中WB信號(hào)最強(qiáng)的克隆進(jìn)入抗體質(zhì)粒重組階段，再進(jìn)一步篩選，選取分泌單克隆抗體最強(qiáng)的配對(duì)進(jìn)入單克隆抗體大轉(zhuǎn)生產(chǎn)。
　　結(jié)果：YCA-10988免疫失敗。YCA-10987和YCA-10989在WB應(yīng)用上有差異，YCA-10987在過(guò)表達(dá)裂解液中能檢測(cè)出強(qiáng)信號(hào)，但在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)出很弱的信號(hào)，而YCA-1