單克隆抗體制備方法(全)

1、單克隆抗體制備方法1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒

2、溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000rmin）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科

3、剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，一般的單克隆抗體制備方法大同小異。方法動(dòng)物的選擇與免疫1.動(dòng)物的選擇BALBC小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開(kāi)展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALAC小鼠。2.免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般

4、在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml0.2ml點(diǎn)）↓3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過(guò)0.5ml）↓3周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5～7

5、天后采血測(cè)其效價(jià)）↓2～3周加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，f5Q5_8OSP20Ag14(SP20)8v7q15OPc2（X63BALBC脾細(xì)胞）雜交瘤s#W2w6U3O)q8氮鳥(niǎo)嘌呤5k4V!n^!T]Nz|)m－

6、“h5ml.r.g%^F0.^“Z.R#U$pd$sO3KBALBC骨髓瘤0Q:y%y“[.A6y8氮鳥(niǎo)嘌呤V9i`Br“j(S%C－7J1hHy$@3u$Rp:L(U1j－6^hsb“DS1945.XXO.BU.1$P“B7YN6E$@kh“|n9F5F5i2f“Vs－!H4f%nm“Ro－:O!X4rGHMPC1145.6TG1.7O.G“mrr2bKR1nrn3o(n210.RCY3.Ag1.2.36“[9A6t~$QLOU大鼠骨

7、髓瘤R210.y$o%QY7Q$N)Xj8氮鳥(niǎo)嘌呤ji:U(g人骨髓瘤U266f#l8z(J0Z9Y(r8氮鳥(niǎo)嘌呤.~R5b“e1H$J7[3Hk4Nfελ)N.I“a7O9Vm3r骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5105ml為宜，最大濃度不得超過(guò)106ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳