鬼臼毒素單克隆抗體制備及其應(yīng)用初步研究.pdf

1、鬼臼毒素是存在于多種植物中的木脂素類化合物，其對(duì)多種害蟲(chóng)有良好的殺蟲(chóng)活性，且作用方式多樣、作用機(jī)理特殊。西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心在對(duì)殺蟲(chóng)植物砂地柏進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，研制開(kāi)發(fā)出以鬼臼毒素為主要成分的新型植物源殺蟲(chóng)劑-0.75％鬼臼毒素乳油。本文以鬼臼毒素為研究對(duì)象，開(kāi)展了鬼臼毒素單克隆抗體制備研究，針對(duì)不同抗原-抗體反應(yīng)特點(diǎn)建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了鬼臼毒素在蔬菜上的殘留檢測(cè)研究。取得如下結(jié)果：

2、 1.采用不同的路線成功地合成了鬼臼毒素的人工抗原。通過(guò)丁二酸酐法成功地合成了半抗原4-O(單)琥珀酰鬼臼毒素；利用混合酸酐法(MAR)和碳二亞胺法(EDC)對(duì)半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，紫外掃描證明成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原；Hapten與BSA的偶聯(lián)比為45.8∶1、Hapten與OVA的偶聯(lián)比為26.5∶1。 2.鬼臼毒素人工抗原免疫Balb/c小鼠后，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)將脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞系SP2/0融合，經(jīng)多次篩選

3、獲得產(chǎn)生陽(yáng)性抗體的雜交瘤細(xì)胞株6E5，植入小鼠腹腔生產(chǎn)腹水獲得高效價(jià)鬼臼毒素單克隆抗體。在優(yōu)化的工作條件下(用含5％甲醇的PBS溶液作為分析物的溶解劑、pH7.4PBS作為抗體的稀釋液、包被抗原稀釋2000倍、抗體稀釋2×104倍做為最佳工作濃度)建立了鬼臼毒素IC-ELISA分析方法，線性檢測(cè)范圍為0.125-389.87ng/mL,半數(shù)抑制濃度(IC50)為6.97ng/mL，最低檢測(cè)線(IC10)為0.0326ng/mL；制備的單

4、抗具有較高的特異性：與脫氧鬼臼毒素的交叉反應(yīng)率為11.6％、與β-阿樸苦鬼臼交叉反應(yīng)率為0.673％、與鬼臼毒素酰肼交叉反應(yīng)率＜0.0697％。 3.在空白青菜樣品中添加0-10μg/mL的鬼臼毒素，經(jīng)IC-ELISA分析鬼臼毒素的添加回收率為79.4-117.00％，變異系數(shù)2.3-15.5；經(jīng)HPLC分析的添加回收率是81.80-114.40％，變異系數(shù)3.1-17.3。鬼臼毒素添加量在0.05-10μg/mL時(shí)，兩種方法的