抗TRPC3多肽單克隆抗體制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、1.研究目的與意義：
　　瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道3亞型(Transientreceptor potential channel3,TRPC3)是一種非選擇性、非電壓控制的陽(yáng)離子通道，其主要功能是調(diào)控Ca2+、Na+等進(jìn)出細(xì)胞，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)主要目的是制備抗TRPC3多肽單克隆抗體(Mono- clonal antibody,McAb)，并初步建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法擬對(duì)TRPC3分子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)用。研究意義在于

2、所制備的抗TRPC3多肽單克隆抗體國(guó)內(nèi)外未見銷售，且這個(gè)單克隆抗體能廣泛應(yīng)用于免疫標(biāo)記技術(shù)，可用于各種TRPC3蛋白表達(dá)的相關(guān)研究。采用已建立的檢測(cè)方法可以測(cè)定與TRPC3蛋白相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化(Atheroscle- rosis,As)、高血壓等疾病的輔助診斷。
　　2.研究的主要內(nèi)容、方法和結(jié)果：
　　2.1.TRPC3多肽抗原的設(shè)計(jì)與合成
　　利用生物信息學(xué)方法分析TRPC3的跨膜結(jié)構(gòu)、胞外區(qū)域，獲得三段線性

3、胞外序列391-418、473-523以及589-637，再根據(jù)B細(xì)胞抗原表位篩選原則，篩選出TRPC3分子的優(yōu)勢(shì)表位肽段509YFTYARDKWLPSDPQ523。該段序列由15個(gè)氨基酸組成，其在抗原指數(shù)、親水性、柔韌性及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析上均相對(duì)其他肽段好。合成的多肽純度＞98％，在與鑰孔嘁藍(lán)蛋白（Keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶聯(lián)后，作為免疫小鼠的免疫原。
　　2.2.制備抗TRPC3多肽單克隆抗體<

4、br>　　用制備的多肽抗原免疫Balb/c小鼠，三次免疫后，測(cè)定小鼠血清免疫效價(jià)。1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高，達(dá)1:2×104，對(duì)1號(hào)小鼠加強(qiáng)免疫后可取脾臟細(xì)胞進(jìn)行下一步融合。用聚乙二醇使小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用HAT、HT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。
　　利用間接ELISA檢測(cè)克隆生長(zhǎng)孔上清液的抗體，篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆。經(jīng)過四次有限稀釋克隆化后，得到八株100%分泌抗TRPC3多肽抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別為A5、B8、B1

5、0、C6、F6、G11、H7和H9。在此基礎(chǔ)上反復(fù)檢測(cè)，最終獲得三株穩(wěn)定分泌抗TRPC3多肽抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別命名為T1、T2、T3。三株小鼠腹水液超濾濃縮后濃度T1為1.884mg/ml，T2為1.787mg/ml，T3為1.648mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，三株超濾濃縮后的腹水液在55KD和25KD處均有清晰條帶，分別是單克隆抗體的重鏈與輕鏈。
　　2.3.雙抗體夾心ELISA法建立及在臨床檢測(cè)的應(yīng)用<

6、br>　　由相對(duì)親和力實(shí)驗(yàn)測(cè)定，T1抗體的相對(duì)親和力最高，為8.255×10-3μg/ml。采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定單抗的敏感性，T1的IC50為10μg/ml，T2的IC50為1.3μg/ml，T3的IC50為2.6μg/ml，敏感度從高到低依次為：T2＞T3＞T1，T2的敏感度最高。在相對(duì)親和力測(cè)定基礎(chǔ)上，進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)，獲得T3+T1配對(duì)組合為最佳配對(duì)方案，當(dāng)包被抗體T3的濃度為0.842μg/ml，配對(duì)抗體T1的濃度為0.235

7、μg/ml時(shí)為其最佳工作濃度。建立的雙抗夾心ELISA法的敏感范圍為0.681-8μg/ml，靈敏度為0.681μg/ml。采用所建立的雙抗體ELISA測(cè)定體系對(duì)AS相關(guān)疾病的血清樣本進(jìn)行TRPC3含量檢測(cè)，初步證實(shí)各病人組高于正常人的值。
　　3.結(jié)論：
　　3.1.在確定TRPC3分子的胞外五段序列基礎(chǔ)上，通過比對(duì)同源性、不同序列的抗原指數(shù)、親水性、柔韌性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的分析，最終決定將509YFTYARDKWLPSD

8、PQ523氨基酸序列作為TRPC3多肽抗原的合成序列，合成TRPC3多肽純度大于98%，合成的多肽抗原與KLH偶聯(lián)后可作為免疫小鼠的免疫抗原。
　　3.2.小鼠免疫后，獲得了抗TRPC3多肽多克隆抗體，多抗效價(jià)為1:2×104；經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選和超濾濃縮等過程，建立了T1、T2、T3三株雜交瘤細(xì)胞系，獲得了抗TRPC3多肽單克隆抗體，其效價(jià)為1:8×104，為單抗的應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.3.通過相對(duì)親和力及抗原表位分