抗膽汁螺桿菌單克隆抗體的研制及其初步應用.pdf

1、以膽汁螺桿菌等為主的嚙齒動物螺桿菌在實驗嚙齒類動物的感染已引起人們的極大關注，使之成為各國實驗動物微生物學質量標準中必須排除的病原菌。但我國尚缺乏有效的檢測方法，至今未將其列入國家標準。血清學檢測方法以其靈敏度高、簡便快捷及費用相對低廉等各種優(yōu)點已經廣泛用于病原微生物感染的實驗室診斷，但其檢測結果準確性的關鍵是檢測試劑的特異性和敏感性。本研究利用B細胞雜交瘤技術制備抗膽汁螺桿菌的特異性單克隆抗體(以下簡稱單抗)，進而建立以檢測抗原為目的

2、的雙抗體夾心ELISA法及間接免疫熒光法，以期發(fā)展起一種特異、敏感和快速的實驗動物膽汁螺桿菌檢測方法。為此，我們從以下幾個方面進行了研究。 首先，單抗的制備與鑒定。使用自行分離自實驗小鼠的膽汁螺桿菌B2m株全菌抗原免疫BABL/c小鼠，經細胞融合，用ELISA法篩選獲得A～K共11個陽性雜交瘤細胞株，其分泌抗體的效價最高達1:4×105以上，并與實驗動物常見的15種病原菌呈陰性反應；IgG亞類為IgG2a和IgG2b；免疫印跡試

3、驗顯示，6株(A～F)與膽汁螺桿菌大約相對分子質量(17、20、21、30、52、66)×103的抗原特異結合，5株(G～K)皆與膽汁螺桿菌、幽門螺桿菌等三種螺桿菌大約相對分子質量(52、82)×103的抗原呈陽性反應，表明A～F株針對的是膽汁螺桿菌特異性抗原，G～K株可能具有屬特異性。 其次，我們建立了以單抗為診斷抗體的雙抗體夾心ELISA法及間接免疫熒光法(IFA)，并初步探索其用于實驗動物膽汁螺桿菌隱性感染檢測的可行性。

4、 在雙抗體夾心ELISA法，采用最佳配對實驗，篩選出以單抗D、E作為包被抗體、C-辣根過氧化物酶標記(C-HRP)作為檢測抗體的配對，對膽汁螺桿菌抗原的檢測限均可達到ng級水平；用于膽汁螺桿菌感染陽性鼠群小鼠盲腸內容物的檢測顯示5/10、4/10的陽性。 在IFA，通過6種單抗的比較，確定了單抗C作為診斷抗體。該單抗與膽汁螺桿菌感染陽性鼠群小鼠盲腸內容物反應，熒光顯微鏡下能清晰地觀察到螺旋狀、周質纖毛纏繞的典型膽汁螺桿菌菌

5、體形態(tài)，與免疫血清比較，背景更清晰，很容易排除假陽性反應，并克服了雙抗體夾心ELISA的不足。其用于膽汁螺桿菌感染陽性鼠群小鼠盲腸內容物的檢測顯示6/10的陽性。 最后，通過PCR法對上述陽性動物群進行檢測，陽性數為8/10。由此可見，雙抗體夾心ELISA法與之符合率為50～60％，IFA符合率為75％。因此，可以認為所建立的兩種血清學方法基本能滿足實驗嚙齒類膽汁螺桿菌隱性感染的檢測。 綜上所述，本研究采用B淋巴細胞雜交