坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒(Tembusu virus)引起的以鴨、鵝等產(chǎn)蛋下降及出血性卵巢炎為特征的新出現(xiàn)的傳染病。根據(jù)其臨床及剖檢癥狀，學(xué)者們?cè)岢隽锁啴a(chǎn)蛋下降綜合征、鴨出血性卵巢炎、鴨病毒性腦炎、鴨鵝腦炎-卵巢炎綜合征、鴨傳染性產(chǎn)蛋減少癥等名稱。該病的流行給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，而目前尚沒有有效的疫苗及藥物控制該病的發(fā)生。E蛋白是坦布蘇病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，位于成熟病毒粒子的表面，它參與病毒的吸附和穿入等過(guò)程，影響病毒毒力及細(xì)

2、胞嗜性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。本研究通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得了能在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的坦布蘇病毒，成功獲得了原核表達(dá)的截短E蛋白，并研制出了針對(duì)E蛋白的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究E蛋白結(jié)構(gòu)和功能、建立坦布蘇病毒的診斷方法、研制新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　1.坦布蘇病毒在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性培養(yǎng)
　　將鵝源坦布蘇病毒SHYG株第4代無(wú)菌尿囊液接種于Vero細(xì)胞并進(jìn)行連續(xù)傳代，分別取第5、10、15、20、2

3、5、30、35、40和45代病毒測(cè)定其TCID50。結(jié)果顯示，第1代病毒培養(yǎng)1周后才能觀察細(xì)胞病變;傳至第20代時(shí)，細(xì)胞病變時(shí)間提前到第3天;通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增E蛋白全基因鑒定，確定引起細(xì)胞病變?yōu)樘共继K病毒;TCID50測(cè)定顯示第5代病毒的滴度為101.67 TCID50/mL，第30代病毒的滴度為106.33 TCID50/mL，病毒滴度呈現(xiàn)一個(gè)逐漸升高并穩(wěn)定的過(guò)程，表明坦布蘇病毒已適應(yīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.坦布蘇病毒截

4、短E蛋白的原核表達(dá)
　　PCR擴(kuò)增出804 bp的截短E蛋白基因，插入pET-32a(+)表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E，利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了主要以包涵體形式存在的重組蛋白，SDS-PAGE顯示，重組E蛋白大小約為48 kDa。包涵體經(jīng)過(guò)溶解、純化及復(fù)性，獲得了濃度為1.239mg/mL的E蛋白，將坦布蘇病毒免疫小鼠所得的血清作為一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果表明獲得的重組蛋白有良好的抗原性。

5、
　　3.坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體的制備
　　以純化的E蛋白免疫6-8周齡BALB/c雌鼠，100μg/只，每?jī)芍苊庖咭淮?，三免后加?qiáng)免疫一次，取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。以純化的E蛋白作為篩選時(shí)的抗原，HIS標(biāo)簽蛋白作為陰性對(duì)照，采用間接ELISA方法篩選出與E蛋白反應(yīng)呈陽(yáng)性，與HIS蛋白反應(yīng)呈陰性的孔進(jìn)行亞克隆，最后獲得3株針對(duì)E蛋白的單克隆抗體，分別命名為1D9B5、1E6C3、3G8F7。其腹水的間接E

6、LISA效價(jià)分別為1∶64000、1∶32000及1∶64000;亞類鑒定結(jié)果表明，1D9B5單抗和3G8F7單抗屬于IgG1亞類，1E6C3單抗屬于IgG2a亞類;間接免疫熒光結(jié)果顯示，3株單抗均能與感染坦布蘇病毒的Vero細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性綠色熒光，與感染禽流感病毒的Vero細(xì)胞反應(yīng)則無(wú)熒光;Western blot顯示3株單抗均能與E蛋白反應(yīng)，而不與HIS標(biāo)簽蛋白反應(yīng)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)連續(xù)傳代的方法得到了能在Ver