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文檔簡介
1、坦布蘇病毒病是由坦布蘇病毒(Tembusu virus)引起的以鴨、鵝等產(chǎn)蛋下降及出血性卵巢炎為特征的新出現(xiàn)的傳染病。根據(jù)其臨床及剖檢癥狀,學者們曾提出了鴨產(chǎn)蛋下降綜合征、鴨出血性卵巢炎、鴨病毒性腦炎、鴨鵝腦炎-卵巢炎綜合征、鴨傳染性產(chǎn)蛋減少癥等名稱。該病的流行給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失,而目前尚沒有有效的疫苗及藥物控制該病的發(fā)生。E蛋白是坦布蘇病毒的主要結構蛋白之一,位于成熟病毒粒子的表面,它參與病毒的吸附和穿入等過程,影響病毒毒力及細
2、胞嗜性,能刺激機體產(chǎn)生中和抗體,誘導保護性免疫應答。本研究通過連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得了能在Vero細胞上穩(wěn)定傳代的坦布蘇病毒,成功獲得了原核表達的截短E蛋白,并研制出了針對E蛋白的單克隆抗體,為進一步研究E蛋白結構和功能、建立坦布蘇病毒的診斷方法、研制新型疫苗奠定了基礎。
1.坦布蘇病毒在Vero細胞上的適應性培養(yǎng)
將鵝源坦布蘇病毒SHYG株第4代無菌尿囊液接種于Vero細胞并進行連續(xù)傳代,分別取第5、10、15、20、2
3、5、30、35、40和45代病毒測定其TCID50。結果顯示,第1代病毒培養(yǎng)1周后才能觀察細胞病變;傳至第20代時,細胞病變時間提前到第3天;通過RT-PCR擴增E蛋白全基因鑒定,確定引起細胞病變?yōu)樘共继K病毒;TCID50測定顯示第5代病毒的滴度為101.67 TCID50/mL,第30代病毒的滴度為106.33 TCID50/mL,病毒滴度呈現(xiàn)一個逐漸升高并穩(wěn)定的過程,表明坦布蘇病毒已適應Vero細胞培養(yǎng)。
2.坦布蘇病毒截
4、短E蛋白的原核表達
PCR擴增出804 bp的截短E蛋白基因,插入pET-32a(+)表達載體構建重組表達質粒pET-32a-E,利用原核表達系統(tǒng)進行誘導表達后,得到了主要以包涵體形式存在的重組蛋白,SDS-PAGE顯示,重組E蛋白大小約為48 kDa。包涵體經(jīng)過溶解、純化及復性,獲得了濃度為1.239mg/mL的E蛋白,將坦布蘇病毒免疫小鼠所得的血清作為一抗進行Western blot,結果表明獲得的重組蛋白有良好的抗原性。
5、
3.坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體的制備
以純化的E蛋白免疫6-8周齡BALB/c雌鼠,100μg/只,每兩周免疫一次,三免后加強免疫一次,取小鼠的脾細胞與SP2/0進行細胞融合。以純化的E蛋白作為篩選時的抗原,HIS標簽蛋白作為陰性對照,采用間接ELISA方法篩選出與E蛋白反應呈陽性,與HIS蛋白反應呈陰性的孔進行亞克隆,最后獲得3株針對E蛋白的單克隆抗體,分別命名為1D9B5、1E6C3、3G8F7。其腹水的間接E
6、LISA效價分別為1∶64000、1∶32000及1∶64000;亞類鑒定結果表明,1D9B5單抗和3G8F7單抗屬于IgG1亞類,1E6C3單抗屬于IgG2a亞類;間接免疫熒光結果顯示,3株單抗均能與感染坦布蘇病毒的Vero細胞反應產(chǎn)生特異性綠色熒光,與感染禽流感病毒的Vero細胞反應則無熒光;Western blot顯示3株單抗均能與E蛋白反應,而不與HIS標簽蛋白反應。
綜上所述,本研究通過連續(xù)傳代的方法得到了能在Ver
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