鴨腸炎病毒糖蛋白B單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE），又名鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck Enteritis Virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。我國動物防疫法將鴨瘟列為三類疫病，是當(dāng)前危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，其特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高。鴨腸炎病毒被劃分為皰疹病毒科未分屬，直徑160~180 nm，基因組大小約為150 K

2、b，由共價連接的獨特長區(qū)（UL）和獨特短區(qū)（US）組成，糖蛋白B由ul27基因編碼，ORF全長3003 bp，含1000個氨基酸殘基，分子量為113.7 Kda。在所有的皰疹病毒中g(shù)B是病毒復(fù)制的必需糖蛋白，在病毒吸附、穿入和介導(dǎo)細(xì)胞間融合中發(fā)揮重要作用，同時gB也是宿主免疫反應(yīng)的主要靶抗原，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、刺激機體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。鴨腸炎病毒gB的功能仍不為人所知，而且鴨腸炎病毒gB的單克隆抗體還未見報道。
　

3、　 本實驗構(gòu)建鴨腸炎病毒糖蛋白B（DEV-gB）真核表達(dá)載體pcDNA3.1-DEV-ul27，以其為免疫抗原，聯(lián)合鹽酸布比卡因免疫BALB/c小鼠，建立篩選抗DEV-gB蛋白單克隆抗體的間接免疫熒光檢測方法。分離免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用平均分布細(xì)胞法，經(jīng)過3~4次克隆，最終共獲得13株分泌單克隆抗體（McAb）的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2G7、3D7、5G5、6A6、6D1、6E10、8A2、9B8、9F4、10H2、

4、11A5、11B4和12G9。染色體數(shù)目介于92~110條之間，分泌單抗的亞類均為IgM型，輕鏈均為κ鏈。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)鑒定可在體外長期培養(yǎng)，并能持續(xù)、穩(wěn)定的分泌抗體。
　　 利用Western blot實驗對13株單克隆抗體識別的抗原肽段進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明2G7、6A6、6D1、6E10、8A2、9F4和11B4均能特異性識別61~110 aa肽段；而單抗3D7、5G5、11A5和12G9識別的抗原表位區(qū)域位于655~720

5、 aa肽段。9B8和10H2這兩株單克隆抗體與截短表達(dá)的蛋白均不發(fā)生反應(yīng)，可能針對的是構(gòu)象表位。
　　 通過Dot-ELISA檢測單克隆抗體與天然病毒粒子的反應(yīng)性，結(jié)果表明8株單克隆抗體可與天然病毒發(fā)生反應(yīng)，分別為：3D7，5G5，6E10，6D1，8A2，9B8，10H2和11B4。
　　 采用微量細(xì)胞病變中和實驗和空斑減數(shù)中和實驗檢測獲得的單克隆抗體的中和活性，結(jié)果表明3D7、6D1、8A2、9B8、11A5和12G

6、9有中和活性，中和3D7和6D1的中和效價為100，其它株為10。
　　 本研究制備了針對鴨腸炎病毒糖蛋白B的單克隆抗體，并對其進(jìn)行Western blot分析、與病毒的反應(yīng)性和中和活性和進(jìn)行了鑒定。把糖蛋白B進(jìn)一步截短表達(dá)，可以用這些單克隆抗體對gB抗原表位進(jìn)行分析；根據(jù)這些單克隆抗體與截短表達(dá)蛋白的反應(yīng)性可以進(jìn)一步確定天然gB具體肽段和抗原表位的功能；應(yīng)用單克隆抗體建立檢測方法，如間接免疫熒光和ELISA檢測病鴨體內(nèi)的抗體水