鴨新城疫病毒的分離鑒定及單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、鴨新城疫，也稱為鴨副粘病毒病(Duckparamyxovirusdisease，DPMV)是由禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-Ⅰ)引起的以腹瀉、癱瘓、神經(jīng)癥狀和消化道、呼吸道粘膜充血、出血或潰瘍等為主要特征的一種急性、高度接觸性傳染病。不同日齡的鴨均易感，且日齡越小，易感性越高，發(fā)病率和死亡率也越高。以往水禽對(duì)APMV-Ⅰ具有較強(qiáng)的抵抗力，儀表現(xiàn)為帶毒，即使強(qiáng)毒感染也不致病(殷震等，1997；Losovacetal.，1988)。但近年來，A

2、PMV-Ⅰ對(duì)鵝、鴨等水禽也產(chǎn)生了較強(qiáng)的致病作用[4-9]。是危害我國水禽業(yè)的一大重要疫病
　　 建立和完善鴨群體內(nèi)DPMV的檢測(cè)手段，是對(duì)該病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防控制的關(guān)鍵。DPMV各毒株之間毒力差異較大，采用常規(guī)的血凝抑制試驗(yàn)不易檢測(cè)出其抗原結(jié)構(gòu)的差異。單克隆抗體能夠識(shí)別刺激宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原表位，具有針對(duì)單個(gè)抗原決定簇的特異性，可以檢測(cè)不同DPMV毒株間抗原表位結(jié)構(gòu)的差異。制備抗鴨副粘病毒(DPMV)的特異性單克隆抗

3、體，可為禽副粘病毒抗原性分析、建立快速檢測(cè)試劑盒和免疫層析膠體金試紙條的研制奠定基礎(chǔ)。建立ELISA檢測(cè)方法和研制膠體會(huì)免疫層析試紙條，便于DPMV臨床大量樣品的快速診斷與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品的快速篩查。
　　 一：鴨新城疫病毒的分離及其F基因的分子特征
　　 從江蘇省某鴨群中分離到1株病毒，經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)和中和試驗(yàn)鑒定為鴨新城疫病毒，命名為JS0920株。生物學(xué)特性測(cè)定：半數(shù)致死量(ELD50)為10-5.3，最小致死量平均死亡

4、時(shí)間(MDT)為47.7h，1日齡SPF雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)為1.875，6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為2.7。動(dòng)物回歸試驗(yàn)：鴨的發(fā)病率為70％，死亡率為40％；雞的發(fā)病率和死亡率均為100％。用RT-PCR方法擴(kuò)增該分離毒株的F基因，序列分析表明，JS0920株與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高，分別為99.2％和99.5％，其多肽裂解位點(diǎn)為112R-R-Q-R-R-F117，具有高致病性鴨新城

5、疫病毒毒株的分子特征：系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，JS0920株與F48E9株的親緣關(guān)系最近，為基因Ⅸ型。
　　 二：鴨新城疫病毒單克隆抗體的制備
　　 采用蔗糖密度梯度離心法提純DPMV，用甲醛滅活，免疫BALB/c小鼠，制備免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接ELISA和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法篩選到4株能穩(wěn)定分泌抗DPMV抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2D7、2F6、3E4和3G2。免疫球蛋白亞類測(cè)定結(jié)果顯

6、示：2D7的Ig亞類為IgG1，2F6為lgG2b，其余2株為IgM，輕鏈均為k型。其中2D7還具有中和活性。特異性測(cè)定結(jié)果顯示四株單抗與NDV、IBV、EDSV-76、IBDV(B87)、AIV(H9N2)及SPF雞胚空白尿囊液均無交叉反應(yīng)。
　　 三：雙抗體夾心ELISA方法的建立及免疫膠體金層析試紙條的研制
　　 采用改良過碘酸鈉標(biāo)記法，用HRP標(biāo)記純化的單克隆抗體2D7，制備2D7-HRP酶標(biāo)抗體復(fù)合物作為檢測(cè)抗

7、體，純化的單抗2F6作為捕獲抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，可檢測(cè)到HA價(jià)為24的DPMV液。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用純化的單克隆抗體2D7標(biāo)記，制備金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜；將純化的2F6固定于硝酸纖維素膜(NC)上作為捕獲抗體；組裝成雙抗央心法DPMV膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。用該試紙條可特異檢測(cè)DPMV，最低可檢測(cè)血凝滴度為25的病毒量，在1～5min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果，特異性強(qiáng)，便于DPMV的臨床快速診斷與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣