新城疫病毒單克隆抗體制備及部分NP蛋白抗原表位鑒定分析.pdf

1、新城疫(ND)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一,目前對其病原新城疫病毒(NDV)進(jìn)行了大量的研究,可是對于NDV編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及致病機(jī)理還未完全闡明。應(yīng)用單克隆抗體仍是對NDV編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析、表位鑒定以及強(qiáng)弱毒鑒別診斷的基本手段之一。
　　 本研究分別構(gòu)建了含有NDV基因Ⅶ型QY97株F基因全長及部分基因片段FA(1-357bo)、FB(336-1047bp)和FC(948-1662bp)的原核表達(dá)載體。經(jīng)IP

2、TG誘導(dǎo)后,在大腸桿菌中成功地表達(dá)了含F(xiàn)蛋白部分片段(FA、FB和FC)分子量分別為30.6ku、43.5ku和43.7ku的3個(gè)融合蛋白,其中FA片段對應(yīng)F2蛋白,FB和FC分別對應(yīng)部分重疊的F1蛋白的兩個(gè)片段。Western-blot結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白FB和FC具有良好的反應(yīng)原性。以原核表達(dá)的融合蛋白FB和FC免疫小鼠,獲得了針對NDVF蛋白FB和FC片段的單克隆抗體各1株,分別命名為FB-B9和FC-B5。
　　 以N

3、DVQY97株全病毒免疫6周齡BALB/c雌性小鼠,采用細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體。經(jīng)間接EIASA和間接免疫熒光試驗(yàn)篩選,共獲得了15株NDV雜交瘤細(xì)胞。其中5A12屬于IgG2a亞型,18C6屬于IgG2b亞型,31B4和33F12屬于IgM亞型,其余均屬于IgG1亞型。這15株單克隆抗體均無中和活性和血凝抑制活性。采用夾心ELISA對不同單抗與10株屬于不同基因型的NDV進(jìn)行交叉反應(yīng),結(jié)果表現(xiàn)出不同的反應(yīng)性。
　　 用純化

4、的NDVOY97株作為抗原,與所獲得的單抗進(jìn)行Western-blot反應(yīng),結(jié)果表明18C6、24F9和25C12與病毒55ku左右的片段反應(yīng),因此這3株單克隆抗體針對的是NDV結(jié)構(gòu)蛋白的線性表位,可能是針對NDVNP蛋白或者F蛋白的單抗,其它幾株單克隆抗體與病毒蛋白沒有明顯的反應(yīng),可能是針對NDV結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)象表位的單抗。
　　 選取10株分屬于基因Ⅰ型、基因Ⅱ型、基因Ⅵ型、基因Ⅶ型和基因Ⅸ型的毒株作為代表株,進(jìn)行了識(shí)別線性表位

5、的3株單抗18C6、24F9和25C12與不同NDV毒株之間的間接ELISA和Western-blot交叉反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果與夾心ELISA結(jié)果相符,單抗18C6只與CK/CH/HLJ/1/06(ZY)、CK/CH/HN/1/07(LHN)、Mallard/CH/HLJ01/06(JL01)和QY97株有反應(yīng)性,24F9與除基因Ⅵ型PG/CH/JS/1/06(Y4)毒株以外的所有毒株有反應(yīng)性,而25C12與10株NDV均有反應(yīng)性。
　

6、　 進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了系列截短的NP蛋白多肽片段,采用Western-blot對18C6和24F9所識(shí)別的線性表位進(jìn)行定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩株單抗都是針對NP蛋白的C-末端,18C6識(shí)別的抗原表位位于NP蛋白的第473-481位氨基酸之間,其多肽序列為473PPPTPGASQ481;24F9識(shí)別的抗原表位位于NP蛋白的第470-478位氨基酸之間,其多肽序列為470HPEPPPTPG478。兩個(gè)抗原表位相互重疊,具有共同的核心序

7、列473PPPTPG478。
　　 本試驗(yàn)擴(kuò)增了4個(gè)分離株的NP基因,進(jìn)行了23株NDVNP基因的序列分析,結(jié)果表明,NP基因全長序列比較保守,但是在C-末端的401-489位氨基酸差異較大,在弱毒株之間比較序列同源率較高,均在83.5％以上;強(qiáng)毒株之間的序列同源率與基因型相關(guān),同一基因型內(nèi)同源率均高于84.4％,但是強(qiáng)弱毒之間的序列同源率有的僅為67％。NP蛋白401-489位氨基酸之間的差異說明NP基因在病毒進(jìn)化過程中也呈現(xiàn)

8、一定的變異規(guī)律。單抗24F9所識(shí)別的470-478位氨基酸序列在各基因型毒株中也有所不同,在NDV基因Ⅶ型毒株的序列中相對比較保守,為470HPEPPPTPG478;而在基因Ⅵ型毒株中的序列為470H(P/L)EP(L/P)(S/P)HE478,第477位的組氨酸未在其它基因型毒株中出現(xiàn);在弱毒株中的序列為470Q(S/L)GPPPTPG478,與強(qiáng)毒株比較至少有三個(gè)氨基酸的差異。
　　 本研究采用全病毒免疫小鼠制備了15株ND