乙型腦炎病毒NS1蛋白單克隆抗體制備及其表位的鑒定.pdf

1、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種以蚊蟲為媒介傳播的人和動物共患的病毒性疾病.乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)與西尼羅病毒(WestNile virus,WNV)、圣路易腦炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus,SLEV)

2、和墨累河谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus,MVEV)同屬一個(gè)血清群。上述病原可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,而且其中的兩種或多種病原往往在同一地區(qū)流行,加之它們在血清學(xué)上存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng),所以建立起針對上述病原的快速、可靠的鑒別診斷方法十分必要。
　　 本研究以本實(shí)驗(yàn)室保存的SA14-14-2株NS1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后,由人工合成,將NS1基因分別亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30和pM

3、AL-c5X構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET-30-opti-NS1和pc5X-opti-NS1-將pET-30-opti-NS1重組質(zhì)粒驗(yàn)證連接正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,將表達(dá)產(chǎn)物純化作為免疫原,免疫6周齡BALB／c小鼠；經(jīng)過免疫、融合、篩選等過程,共獲得16株特異性針對NS1蛋白的單克隆抗體,IFA表明其中8株能識別天然狀態(tài)下的NS1蛋白；將pc5X-opti-NS1重組質(zhì)粒驗(yàn)證連接正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)

4、胞ER2523,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組的NS1蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中得到大量表達(dá),并部分以可溶形式存在。Western blot和間接ELISA檢測表明該重組NS1蛋白能與豬JEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。以pc5X-opti-NS1表達(dá)的MBP—NS1蛋白為檢測用抗原,建立間接ELISA檢測方法篩選分泌NS1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
　　 設(shè)計(jì)一套包含整個(gè)NS1蛋白的51個(gè)短肽片段,每個(gè)肽段長

5、度為16aa,每兩個(gè)相鄰的短肽之間有8aa的重疊。為表達(dá)這些短肽,首先人工合成了表達(dá)它們的基因,在編碼鏈的5’端引入BamHI位點(diǎn),3’端引入XhoI位點(diǎn)。這51個(gè)肽段經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后得到了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物與制備的單克隆抗體100816-10F7、100816-885、100910-1E8、100816-7G1、100816-4E3、100910-6D8作用,ELISA結(jié)果與單抗100816-10F7、100816-885、100910-