寨卡病毒NS5單克隆抗體的制備及NS1蛋白在桿狀病毒中的表達研究.pdf

1、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），該病毒感染人體后能夠跨過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而導(dǎo)致胎兒大腦畸形，青少年格林-巴利綜合征等。到目前為止，仍然沒有商品化疫苗和抗病毒藥物上市。NS5是ZIKV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，由一個甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase，MTase)和一個依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polym

2、erase，RdRp)組成，與病毒復(fù)制、RNA加帽和抑制宿主天然免疫反應(yīng)有關(guān)。而NS1是ZIKV另一個重要非結(jié)構(gòu)蛋白，可以通過抗體依賴的細胞毒性（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity,ADCC）和補體依賴途徑誘導(dǎo)感染細胞產(chǎn)生保護性非中和抗體，故用該蛋白來研制ZIKV疫苗及治療藥物，有更強的安全性。
　　本研究通過制備ZKIV NS5蛋白的單克隆抗體以及構(gòu)建表達NS1蛋白的重組桿狀病毒，以

3、期為ZIKV復(fù)制機制和疫苗研發(fā)提供重要材料。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.ZIKV NS5蛋白單克隆抗體的制備
　　從感染ZIKV MR766毒株的細胞中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板，通過PCR擴增NS5基因序列。然后將其克隆至原核表達載體pET-28a中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-28a-ZIKV-NS5。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、包涵體純化，獲得ZIKV NS5蛋白。用純化的ZIKV NS5蛋白免疫4周齡BALB/

4、c小鼠，經(jīng)細胞融合、ELISA及亞克隆，篩選出10株能夠穩(wěn)定分泌ZIKV NS5單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株。分別命名為:1H5、1D3、1D11、2A11、2C1、3A2、3A7、4D11、4F12和4G11。通過間接免疫熒光和Western Blot驗證，結(jié)果表明10株單抗均能與ZIKV反應(yīng)，且1D3、1D11、3A7、4F12四株單克隆抗體還與登革熱病毒交叉反應(yīng)。
　　2.構(gòu)建表達ZIKV NS1蛋白的重組桿狀病毒
　

5、　將ZIKV NS1基因克隆至桿狀病毒載體pFastBac1中，構(gòu)建桿狀病毒重組質(zhì)粒。將帶信號肽的重組質(zhì)粒pFastBac1-ZIKV-F-NS1和不帶信號肽的重組質(zhì)粒pFastBac1-ZIKV-NS1轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)中，獲得桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-ZIKV-F-NS1/rBacmid-ZIKV-NS1;穿梭質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染至sf9(Spodoptera Frugiperda,sf9)細胞中，獲得分泌表達ZIKV NS1蛋