1型鴨肝炎病毒VP1蛋白的表達(dá)純化及單克隆抗體的制備.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的一種主要發(fā)生于4周齡以下雛鴨的傳播迅速、高度致死性的傳染病。在我國爆發(fā)的鴨肝炎主要是由DHV-I引起,雛鴨一旦感染DHV死亡率為100％。本實(shí)驗(yàn)對DHV-I的EFl4株VP1基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增。建立了重組表達(dá)質(zhì)粒,命名為pET30a-VP1。并制備了純度較高的DHV-I抗原,以此免疫Balb/c小鼠并建立了間接ELISA篩選方法。經(jīng)過一系列的融合篩選,成功研制了抗I型DHV單克

2、隆抗體3株。本實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)室建立DHV快速診斷方法及今后對DHV-I的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)GenBank發(fā)表的DHV-I全基因組序列設(shè)計(jì)合成一對引物(含有BamHI和XhoI兩個酶切位點(diǎn)),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增VP1基因,并克隆入pMD18-T載體,測序鑒定。將陽性VP1基因插入表達(dá)載體pET30a中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-VP1,進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,并使其在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)。融合蛋白為包涵體形式存在,

3、經(jīng)超聲破碎后,利用SDS-PAGE電泳觀察外源基因表達(dá)條帶大小是否與預(yù)期相符。并對融合蛋白進(jìn)行純化。用純化的蛋白作為抗原來免疫Balb/c小鼠后建立間接ELISA篩選方法。細(xì)胞融合前反復(fù)試驗(yàn),確定了間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件,陽性血清和陰性血清分別作為陽性和陰性對照。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,用間接ELISA方法篩選出3株陽性雜交瘤細(xì)胞株,將獲得的陽性細(xì)胞株用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆,分別命

4、名為2D9、2D10和5F7。最后將擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注入Balb/c小鼠腹腔,每只注射2×106個細(xì)胞使其產(chǎn)生腹水,制備單克隆抗體。對這3株單克隆抗體的穩(wěn)定性、抗體亞類、腹水效價、特異性進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所獲得的單抗均具有良好的特異性。
　　 本研究成功制備了3株能穩(wěn)定分泌抗DHV-IVP1蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,試驗(yàn)表明已經(jīng)掌握了體外細(xì)胞分離培養(yǎng)、抗原鑒定純化以及細(xì)胞融合技術(shù),這為制備更多的單抗、研制抗原檢測