中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒VP1蛋白單克隆抗體制備及宿主免疫相關(guān)基因研究.pdf

1、囊狀幼蟲(chóng)病(Sacbrood Disease，SBD)是中華蜜蜂(Apis cerana cerana，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為中蜂)幼蟲(chóng)期最主要的病毒性病害，可導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡，進(jìn)而蜂群數(shù)量急劇減少。中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒(Chinese Sacbrood Virus，CSBV)是引起中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病的病原，已成為近幾年來(lái)在蜜蜂中分布最為廣泛的病毒之一。本文在調(diào)查中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒流行分布規(guī)律的基礎(chǔ)上，對(duì)CSBV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了研

2、究，并對(duì)響應(yīng)CSBV感染的兩個(gè)免疫相關(guān)基因SRP9和GABARAP進(jìn)行了分子克隆、生物信息分析和原核表達(dá)研究。
　　主要結(jié)果如下:
　　1、中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒檢測(cè)及流行規(guī)律調(diào)查。采用RT-PCR方法，病毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CSBV感染率高達(dá)94.59％，其次為黑蜂王臺(tái)病毒(Black queen cell virus，BQCV)，檢出率達(dá)77.03％。說(shuō)明CSBV是中華蜜蜂中發(fā)病率最高的病毒。在我國(guó)東北、華北、華中、華南、西南、東

3、部均能檢測(cè)到CSBV病毒，發(fā)生的地點(diǎn)與我國(guó)主要的流蜜期路線相吻合，且存在廣泛的混合感染問(wèn)題。全年發(fā)生情況一直較為嚴(yán)重，春繁時(shí)期最易感染，呈現(xiàn)1-4月份逐步升高的趨勢(shì)，6-9月份有所緩和，但10-11月份后又開(kāi)始上升。
　　2、中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒純化及電鏡觀察。采用超高速離心和蔗糖密度梯度離心的方法，獲得了CSBV-BJ和CSBV-SX兩個(gè)純化CSBV病毒。實(shí)驗(yàn)觀察到CSBV-BJ和CSBV-SX病毒粒子，病毒粒子的形狀接近圓形(

4、直徑約30nm)，接近二十面體的球形。
　　3、中華蜜蜂囊狀幼蟲(chóng)病毒VP1蛋白單克隆抗體制備。對(duì)CSBV-BJ-VP1進(jìn)行克隆，獲得有效序列長(zhǎng)945bp，編碼315個(gè)氨基酸，Nbp/3。該基因的預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別約為35.59kDa和9.38。對(duì)VP1進(jìn)行原核表達(dá)，構(gòu)建pET-32a-CSBV-BJ-VP1質(zhì)粒，優(yōu)化原核表達(dá)條件，在37℃培養(yǎng)，菌株OD600=1.0，IPTG濃度為1.0mM時(shí)，獲得重組蛋白。將該蛋白免疫小鼠，

5、成功制備了2株VP1單克隆抗體腹水，單抗的亞類(lèi)均為IgG2a，輕鏈為κ鏈。
　　4、中華蜜蜂SRP9基因克隆、生物信息分析及原核表達(dá)。采用RT-PCR方法，擴(kuò)增有效序列長(zhǎng)為237bp，編碼78個(gè)氨基酸，(Nbp-3)/3，相對(duì)分子量為9.36kDa，等電點(diǎn)為9.17。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，中華蜜蜂SRP9與西方蜜蜂Apis mellifera和小蜜蜂Apis florea的SRP9聚成一支。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)α-螺旋區(qū)

6、和3個(gè)β-折疊區(qū)。同源建模獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。原核表達(dá)后發(fā)現(xiàn)該重組蛋白表達(dá)在包涵體中，經(jīng)洗包涵體方法純化，獲得了帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白。采用熒光定量PCR方法，研究了SRP9基因的表達(dá)特性，結(jié)果表明，在接種CSBV后，中蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)SRP9基因表達(dá)量顯著提高。
　　5、中華蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息分析及原核表達(dá)。采用RT-PCR方法，擴(kuò)增獲得有效序列354bp，編碼117個(gè)氨基酸，(Nbp-3)/3，預(yù)測(cè)分子量為13

7、.99kDa，等電點(diǎn)為9.48。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，中華蜜蜂GABARAP與同西方蜜蜂Apis mellifera、小蜜蜂Apis florea、大蜜蜂Apis dorsata、歐洲熊蜂Bombus terrestris、東方熊蜂Bombus impatiens的GABARAP蛋白處于同一個(gè)簇中。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有3個(gè)α螺旋和4個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。同源建模獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。原核表達(dá)后發(fā)現(xiàn)該重組蛋白表達(dá)在包涵體中，經(jīng)His標(biāo)簽蛋白