禽腦脊髓炎病毒VP1基因的克隆、表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、禽腦脊髓炎(AE)是一種由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的以侵害幼禽中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要特征的接觸性傳染病，以病禽共濟(jì)失調(diào)、震顫和非化膿性腦脊髓炎為主要特征，雞、火雞、野雞、鵪鶉均可感染。1930年首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)該病，現(xiàn)已遍及世界大多數(shù)國(guó)家。我國(guó)自1980年以來，先后在廣東、江蘇、遼寧、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、福建、上海等省市區(qū)發(fā)生，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成很大危害。 禽腦脊髓炎病毒(AEV)的培養(yǎng)較為困難，從而影響了對(duì)該病的深入研究。目前一般都

2、采用免疫學(xué)方法，如免疫熒光(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來直接檢測(cè)抗原，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力；國(guó)外也有用AEV單克隆抗體建立的免疫組化、間接免疫熒光和免疫過氧化物酶染色等方法檢測(cè)AEV抗原的成功報(bào)道。 本研究的目的是運(yùn)用基因工程技術(shù)克隆出AEV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因，并以重組蛋白為抗原制備特異性抗體，為快速大量制備AE的檢測(cè)抗原提供了條件，也為建立快速診斷和檢測(cè)AEV的特異性方法奠定了基礎(chǔ)。為此，主要有如下工作： 1.AEV

3、結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的克隆和原核表達(dá)以初步純化的AEVVR株提取的RNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的AEV1143株結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，分別在上游引物引入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoI酶切位點(diǎn)。經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增出AEV結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1，克隆入pGEM-Teasy載體并經(jīng)測(cè)序分析，VP1基因全長(zhǎng)約為810bp，與已發(fā)表的AEVVR株VP1序列完全一致，與1143株VP1基因序列同源性為94.7％。純化后用E

4、coRI和XhoI雙酶切，將VP1基因定向克隆入pGEX-6P-1載體谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因的下游，并把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，VP1基因得以表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，確定表達(dá)的融合蛋白大小約為58kD。 2.禽腦脊髓炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的單克隆抗體的制備及初步鑒定 以重組蛋白(pGEX-VP1)表達(dá)并純化的融合蛋白GST-VP1作為抗原，免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，末次加強(qiáng)免

5、疫后3d取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，由HAT選擇培養(yǎng)，通過間接ELISA反復(fù)篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行3次以上的亞克隆，得到兩株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株：H7和E3，并制備了腹水，腹水效價(jià)分別為16log2，14log2；Western-blot結(jié)果顯示該單抗有較強(qiáng)的特異性，且不與GST反應(yīng)；利用該單抗初步建立了間接ELISA、特異性試驗(yàn)等檢測(cè)AEV抗原的方法，為進(jìn)一步建立特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便快速的AEV