臨床新城疫病毒分離鑒定及F蛋白單克隆抗體的研制與應(yīng)用.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的一種重要傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，OIE將其與高致病性禽流感一起列為危害養(yǎng)禽業(yè)必須報告的疫病，該病在我國時有發(fā)生。自1997年以來，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)不僅感染雞，而且還感染鵝。雖然各地采取了積極的防治措施，但該病仍然蔓延、流行。有不少學(xué)者對此進(jìn)行了研究，但有關(guān)病原的生物學(xué)特性及流行病學(xué)等方面仍存在很多疑問。

2、>　　 本研究從臨床采集30例疑似新城疫病死雞腦、肝等組織和從自然保護(hù)區(qū)采集3例野鴨棉拭子，通過SPF雞胚接種分離病毒，并對分離獲得的病毒進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，分離獲得的19株病毒有血凝性，經(jīng)HA、HI以及IFA試驗驗證，其中18株為NDV。應(yīng)用RT-PCR方法對分離株NDV的融合蛋白F基因和血凝素神經(jīng)氨酸酶HN基因進(jìn)行擴(kuò)增，序列分析結(jié)果表明，分離株DTC-050508和三株野鴨源NDV在第112、115位是堿性氨基酸，第117位是F

3、(Phe)具有NDV強(qiáng)毒的特征，DTC-050408在第112、115位是中性氨基酸，第117位是L(Leu)具有NDV弱毒的特征。進(jìn)一步分析表明，野鴨源NDV與鵝源NDV在基因序列有很高的同源性。
　　 對野鴨源NDV分離株JS0601/wd的全基因組進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明，該病毒全基因組長15192bp，與GenBank上已發(fā)表的ZJ1、NA-1、SF02、IT-227、ITdove等毒株基因組全長相同，各編碼蛋白基因位置

4、基本一致，說明NDV病毒基因組結(jié)構(gòu)在不同宿主遺傳進(jìn)化上具有保守性。JS0601/wd基因組編碼的NP、P、M、F、HN和L蛋白的長度與分離株ZJ1、NA-1、SF02等完全一致，與我國近年來流行于鵝的NDV同源性高達(dá)97％以上，說明他們可能有相同的來源和遺傳進(jìn)化關(guān)系，為我國NDV流行病學(xué)研究和控制提供了重要資料。
　　 在用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8株F基因的基礎(chǔ)上，利用表達(dá)的重組蛋

5、白免疫小鼠，通過間接免疫熒光篩選雜交瘤細(xì)胞，結(jié)果獲得了12株抗NDVF蛋白單克隆抗體，分別命名為1B4、4B11、5F3、4C1、2H10、6F8、4H10、1D10、2F12、4D9、5C6、6C4。血凝和血凝抑制試驗表明，所有單抗均無血凝抑制特性；中和試驗結(jié)果證明，單抗4D9具有很好的中和能力，6C4、2F12有一定程度的中和效價，其他單抗沒有明顯的中和作用；盡管在IFA試驗中，不同單抗與不同動物來源的NDV表現(xiàn)出不同的免疫反應(yīng)性和

6、反應(yīng)譜，但在Western blot試驗中，所有單抗均能識別不同來源NDV的F蛋白，這些單抗為NDV的深入研究提供了高質(zhì)量試劑材料。
　　 為了解決臨床上ND的快速診斷問題，本研究以研制的單抗為核心試劑，建立了間接免疫熒光技術(shù)快速檢測NDV的方法。研究結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)，與試驗的其他病毒如傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病毒及小鵝瘟病毒等均不出現(xiàn)交叉反應(yīng)，僅與NDV感染的CEF反應(yīng)，該方法可以在18h檢測出NDV，顯示出很好的應(yīng)