犬瘟熱病毒的分離及單克隆抗體的研制.pdf

1、犬瘟熱(CD)是一種由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬急性傳染病。CDV屬于副粘病毒科的麻疹病毒屬。主要引起犬科、鼬科和浣熊科動(dòng)物犬瘟熱的發(fā)生，大熊貓和小熊貓等我國(guó)珍稀野生動(dòng)物也不能幸免。但是伴隨生態(tài)環(huán)境的變化和CDV對(duì)動(dòng)物流行病因素的適應(yīng)，它的自然感染宿主范圍在不斷擴(kuò)大。 一、表達(dá)犬CD150的Vero細(xì)胞系的建立及犬瘟熱病毒的分離犬瘟熱病毒的分離和培養(yǎng)是確診犬瘟熱的最根本方法，選擇適合的細(xì)胞是分離和培養(yǎng)的關(guān)鍵。目前，在用Vero

2、細(xì)胞系進(jìn)行CDV分離和培養(yǎng)時(shí)，需要傳代數(shù)次或添加胰酶，才有可能產(chǎn)生細(xì)胞病變，而有些CDV毒株經(jīng)處理后仍不能產(chǎn)生細(xì)胞病變，這樣就給CDV的研究帶來(lái)不便。有報(bào)道稱，淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子(SLAM，CDl50)是CDV等病毒的受體。本研究通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增犬白細(xì)胞中的CDl50基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體plRES-CDl50，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，利用G418進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行培養(yǎng)，建立了Vero-CDl50細(xì)胞系。通過(guò)PCR技術(shù)和流式細(xì)

3、胞術(shù)對(duì)Vero-CDl50細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，同時(shí)檢測(cè)該細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性和培養(yǎng)特性，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系培養(yǎng)方法與Vero細(xì)胞相似，且多次傳代復(fù)蘇后，仍能穩(wěn)定表達(dá)CDl50基因。利用Vero-CDl50細(xì)胞系分離CDV，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，且通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出病毒的特異性片段，將分離到的一株CDV命名為CDV0701株。 二、犬瘟熱病毒H、F基因的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出CDV0701株血凝素蛋白(H)基因

4、以及融合蛋白(F)基因，將H基因和F基因分別插入原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中谷胱甘肽S．轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游，獲得重組質(zhì)粒pGEX-H和pGEX-F。通過(guò)對(duì)重組大腸桿菌的菌體裂解物的SDS．PAGE電泳分析表明，重組菌能正確表達(dá)GST-H和GST-F融合蛋白。分別以純化的融合蛋白GST-H和GST-F免疫BAIJB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0胃髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELJSA)篩選分泌單克隆抗體的雜交

5、瘤細(xì)胞。獲得2株針對(duì)CDV H蛋白的單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4A10和2D5，其腹水型效價(jià)分別為2.56×104、2.56×104；獲得3株針對(duì)CDV F蛋白的單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3E10、5F9和1G2，其腹水型效價(jià)分別為1.28×104、1.28×104、2.56×104。ELISA和Western-blot分析結(jié)果顯示，以上5株單抗僅與對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)反應(yīng)，而與原核表達(dá)載體pGEX-6P-1蛋白不反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)顯示