犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及其應用.pdf

1、犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。該病傳染性強、發(fā)病率和死亡率高，并可引起機體免疫抑制，已成為養(yǎng)犬業(yè)、經濟動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護業(yè)危害最嚴重的傳染病之一。因此，建立一種快速、特異的檢測方法對該病的防控十分重要。本研究旨在制備CDV特異性單克隆抗體，建立基于單克隆抗體的CDV檢測方法，同時選擇具有中和活性的單克隆抗體制備CD單克隆抗體治療劑。試驗內容包括:
　　 實驗1:犬瘟熱病毒的分離及

2、其核衣殼蛋白基因序列分析從非典型犬瘟熱(CD)病犬的肺和肝臟組織中分離犬瘟熱病毒(CDV)，用RT-PCR方法擴增核衣殼蛋白(N)基因，進行克隆和序列分析。結果表明:該CDV分離株N基因與已發(fā)表的12個CDV強毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別在96.6％～99.2％和97.9％～99.4％之間，與已發(fā)表的4個CDV疫苗弱毒株的同源性分別在93.2％～93.6％和96.4％～97.5％之間;在N基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹上，該CDV分離株與

3、12個強毒株處在同一亞群，而且與9個中國分離毒株的親緣關系近于3個國外毒株。將N基因插入到原核表達載體pET-28a(+)構建原核表達質粒pET-N，在大腸桿菌中表達的重組N蛋白的分子量為62kDa，主要以包涵體的形式存在;用Western blotting分析，重組N蛋白可與CDV陽性血清發(fā)生特異性反應。
　　 實驗2:分泌犬瘟熱病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立用純化的犬瘟熱病毒(CDV)免疫BALB/c小鼠，制備脾細胞，與S

4、P2/0骨髓瘤細胞融合，經間接ELISA篩選和克隆化，獲得5株能穩(wěn)定分泌CDV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為3H11、1D7、2C9、1F8和3G3，抗體亞類分別為IgG2bκ、IgG1κ、IgG2bκ、IgG1κ和IgG1κ，誘生腹水的抗體效價分別為109、107、106、107和106。細胞染色體分析表明，5株雜交瘤細胞株染色體平均數(shù)為88～96條，高于SP2/0骨髓瘤細胞或脾細胞的染色體數(shù);間接免疫熒光試驗(IFA)證明，5

5、株單抗均與CDV發(fā)生特異性反應;免疫印跡(western blotting)分析，單抗1F8和3G3能特異地識別CDV的N蛋白;在病毒中和試驗中，單抗3H11和1D7的病毒中和效價分別為105和106，其它3株單抗則沒有中和活性;經ELISA相加試驗證實，5株單抗作用的抗原位點不同。
　　 實驗3:犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA檢測方法的建立用純化的犬瘟熱病毒(CDV)單克隆抗體1D7作為捕獲抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標

6、記的單克隆抗體1F8作為檢測抗體，建立檢測CDV的單克隆抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化的試驗反應條件為:單克隆抗體1D7的包被濃度為2μg/mL，用10％小牛血清封閉，酶標單克隆抗體1F8的稀釋度為1∶4000。特異性試驗證明，單克隆抗體夾心ELISA方法與犬細小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠狀病毒(CCV)無交叉反應;敏感性試驗顯示，該方法檢測CDV病毒量的最低限為102 TCID50/mL;

7、重復性試驗表明，夾心ELISA方法批內、批間變異系數(shù)小于5％。該單克隆抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，可用于犬瘟熱病毒(CDV)的臨床檢測。實驗4:犬瘟熱病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測試紙條的制備用膠體金標記純化的單克隆抗體1F8，捕獲CDV抗原，將純化的單克隆抗體1D7和羊抗鼠IgG抗體包被于硝酸纖維素膜(NC膜)，分別作為檢測線和對照線，制備犬瘟熱病毒膠體金免疫層析檢測試紙條。優(yōu)化的試驗反應條件為:膠體

8、金標記抗體的最適pH值為8.0，被標記單克隆抗體1F8濃度為18μg/mL，包被于NC膜的抗體1D7和羊抗鼠IgG抗體的濃度分別為1.4mg/mL和2.0mg/mL。用該試紙條可特異地檢測犬瘟熱病毒，檢測CDV病毒量的最低限為103TCID50/mL，與相同單克隆抗體1D7和1F8建立的犬瘟熱病毒夾心ELISA檢測方法的敏感度相當，在1～5min內可得出檢測結果，試紙條簡便快速，便于犬瘟熱的臨床快速診斷。
　　 實驗5:犬瘟熱單