柑橘碎葉病毒和香蕉束頂病毒單克隆抗體的制備及其檢測(cè)應(yīng)用.pdf

1、制備重要植物病毒的特異性抗體、建立相應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)植物病毒的檢測(cè)及其口岸檢驗(yàn)檢疫和科學(xué)防治具有重要意義。柑橘碎葉病毒（Citrus TatterLeaf Virus，CTLV）為我國(guó)繼柑橘衰退病和裂皮病之后的一種重要的柑橘病毒病之一，而香蕉束頂病毒（Banana Bunchy Top Virus，BBTV）引起的香蕉束頂病是香蕉上的重要病害，其威脅著包括亞洲、非洲、南太平洋地區(qū)約占世界四分之一香蕉的生產(chǎn)。本論文分別制備了抗CTLV

2、和BBTV的特異性單克隆抗體(monoclonal antibodies，MAbs)，并建立了相應(yīng)的的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　(1)抗CTLV單克隆抗體制備及其檢測(cè)應(yīng)用:用PCR方法從感染CTLV的柑橘基因組中克隆了該病毒的外殼蛋白(Coat protein，CP)基因，將其插入到原核表達(dá)載體PET-28a中構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體。重組表達(dá)載體PET-28a-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Ni-NTA親和柱純化

3、獲得分子量約為30kDa的融合蛋白。以純化的重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，獲得3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗CTLV的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。分泌的單抗特異性檢測(cè)表明3株單抗能特異性識(shí)別CTLV。利用3株單抗建立了檢測(cè)CTLV的dot-ELISA方法，該方法檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)1∶640(w/v，g/mL)。
　　(2)抗BBTV單抗制備及其檢測(cè)應(yīng)用:將經(jīng)BBTV病毒粒子免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)細(xì)

4、胞篩選與克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗BBTV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞22E3，并制備其單抗腹水。該單抗可以特異性地與BBTV反應(yīng)，利用單抗為核心建立了檢測(cè)BBTV的抗原包被間接ELISA方法(antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay, ACP-ELISA)和免疫斑點(diǎn)法(dot-ELISA)。建立的dot-ELISA方法檢測(cè)感染的香蕉植株組織的靈敏度達(dá)1∶320(w/v