抗豬免疫球蛋白單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬傳染性疾病給我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的危害。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法難以了解豬群的早期發(fā)病情況，同時(shí)也無(wú)法區(qū)分抗體性質(zhì)，影響了診斷傳染病的準(zhǔn)確性。隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，深入研究這些疾病免疫特點(diǎn)，提高免疫監(jiān)測(cè)和診斷能力，對(duì)預(yù)防該類傳染性疾病已迫在眉睫。研制豬免疫球蛋白的單克隆抗體，對(duì)于進(jìn)一步研究豬傳染性疾病具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本文主要研究了抗豬免疫球蛋白單克隆抗體的制備和鑒定。首先，采用飽和硫酸銨鹽析和SephadexG

2、-200柱層析法從豬血清中獲得IgM和IgG，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的IgM和IgG達(dá)到了電泳純。Folin-酚法測(cè)定IgM和IgG濃度，分別為0.7mg/mL和2mg/mL。 其次，采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，兩組方法分別建立并優(yōu)化后得出以下最佳反應(yīng)條件。豬IgM包被的間接ELISA篩選方法：抗原包被量為0.25μg/mL，陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清稀釋度為1∶2000，酶標(biāo)抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1

3、∶20000；豬IgG包被的間接ELISA篩選方法：抗原包被量為0.1μg/mL，陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清稀釋度為1∶2000，酶標(biāo)抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1∶20000。 最后，用純化后的豬IgG，采用常規(guī)免疫法免疫6-8周齡雌性BABL/c小鼠。取三次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按10∶1混合，用1mL50％PEG3000進(jìn)行細(xì)胞融合，10-15天后初次檢測(cè)。試驗(yàn)中共融合兩次，兩次融合率分別為84.4％和75

4、％，初檢陽(yáng)性率分別為13％和4.5％。經(jīng)兩次亞克隆后，共獲得兩株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C11和G3。兩株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外多次傳代培養(yǎng)后，仍能分泌高效價(jià)的抗體，且細(xì)胞上清效價(jià)均穩(wěn)定在1∶64～128之間。用12周齡以上的BABL/c小鼠大量制備單抗腹水，G3株小鼠腹水單抗ELISA效價(jià)為1∶12800以上。經(jīng)HBTMouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit鑒定，C11細(xì)胞株為IgM類，