抗豬IgG單克隆抗體的制備和標(biāo)記.pdf

1、采集健康豬血清,以辛酸-硫酸銨法提取豬IgG,利用Hiload16/60 superdex200預(yù)裝凝膠柱對(duì)粗提豬IgG進(jìn)行純化,上樣量2mL,流速0.2mL/min,收集不同洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,以Bradford法測(cè)定純化蛋白濃度,獲得高純度豬IgG蛋白。
　　 用純化的豬IgG蛋白為抗原免疫6-8周齡BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)在聚乙二醇作用下進(jìn)行融合,以HAT培養(yǎng)基選擇性

2、培養(yǎng)后,經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法克隆化,獲得8株穩(wěn)定分泌抗豬IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2E11、3E12、4C10、5A4、5C11、5D7、6H3和7H1,其細(xì)胞上清和腹水ELISA抗體效價(jià)分別為1:320-1:6400和10-6-10-7。Ig亞類分析表明,除6H3為IgG2b外,其余7株均屬于IgG1,輕鏈亞類均為κ。Western-blotting結(jié)果顯示,單克隆抗體3E12、4C10和5C11識(shí)別豬Ig

3、G重鏈,其余5株單克隆抗體識(shí)別豬IgG輕鏈。以ELISA和Western-blotting測(cè)定單克隆抗體與其它動(dòng)物IgG/IgY的交叉反應(yīng)性,結(jié)果顯示單克隆抗體2E11、5D7、5A4、6H3和7H1可識(shí)別鴨、鵝、斑頭雁、鸕鶿等水禽IgY輕鏈的共同表位。ELISA抗體相加試驗(yàn)的表位分析表明,8株單克隆抗體共識(shí)別3個(gè)不同的抗原表位,分別命名為重鏈IgG-H1、輕鏈IgG-L1和輕鏈IgG-L2,其中3E12、4C10、5C11識(shí)別重鏈Ig

4、G-H1表位;5D7、7H1識(shí)別輕鏈IgG-L1表位;2E11、5A4、6H3識(shí)別輕鏈IgG-L2表位。
　　 以辛酸-硫酸銨法和蛋白G柱親和層析純化7H1單克隆抗體腹水IgG,采用改良過(guò)碘酸鈉法(不同的酶/抗體質(zhì)量比)和戊二醛法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記,對(duì)酶標(biāo)抗體標(biāo)記效果的測(cè)定表明,酶/抗體質(zhì)量比為1:1的改良過(guò)碘酸鈉法酶標(biāo)效率最高,其酶標(biāo)抗體克分子比為2.16,酶標(biāo)記率為20.32％,直接ELISA效價(jià)為