豬生長(zhǎng)激素單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、豬生長(zhǎng)激素(porcinegrowthhormone,pGH)又稱豬促生長(zhǎng)素(porcinesomatotropin,pST)，是由豬腦垂體前葉以脈沖方式分泌的約191個(gè)氨基酸的肽類激素，是調(diào)節(jié)豬正常生長(zhǎng)和發(fā)育的主要激素之一。它能促進(jìn)葡萄糖吸收、核酸與蛋白質(zhì)的合成以及脂肪的分解，提高豬的生長(zhǎng)速度，飼料報(bào)酬和瘦肉率。近年來(lái)隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展及pGH單克隆抗體的成功制備，為建立pGHELISA測(cè)定技術(shù)提供了可能。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELI

2、SA)由于具有無(wú)放射性污染、特異性強(qiáng)、靈敏度高、測(cè)定周期短、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高等許多優(yōu)點(diǎn)，因而受到人們的普遍關(guān)注和重視。靈敏的ELISA檢測(cè)方法的建立，為開展豬生長(zhǎng)發(fā)育及生殖的GH調(diào)控及GH基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的研究提供了一種行之有效的GH檢測(cè)手段，對(duì)內(nèi)分泌學(xué)的研究進(jìn)程具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。 本試驗(yàn)采用豬生長(zhǎng)激素(pGH)免疫家兔制備了抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨粗提得到兔抗pGH的IgG抗體，SDS-PAGE鑒定抗體的純度，紫外分光光度

3、計(jì)測(cè)定蛋白含量達(dá)到21mg/mL；選取BALB/c小鼠，以豬生長(zhǎng)激素純品為抗原，進(jìn)行免疫，脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞。獲得了三株穩(wěn)定分泌豬生長(zhǎng)激素單克隆抗體的雜交瘤株，分別為3B12、2D4和2G11。和本課題組以前保存的其他三株單抗(1A3、1A5和1B5)同時(shí)進(jìn)行效價(jià)、親和力、Ig亞類及抗原識(shí)別位點(diǎn)等特性的鑒定，篩選出一株親和力和效價(jià)都較好的單克隆抗體(1A3)。雙抗體夾心法采用一株抗pGH的單克隆抗體(1A3)為包被

4、抗體，以識(shí)別和結(jié)合待檢標(biāo)本中的pGH，兔抗pGH多抗可與pGH分子的另外表位結(jié)合，后加入HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為酶標(biāo)抗體，并催化底物顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中的pGH含量，成功地建立了pGH的雙抗體夾心ELISA法。標(biāo)準(zhǔn)品中pGH含量在15.62ng/mL～1.0μg/mL范圍內(nèi)，濃度對(duì)數(shù)與其OD490m值呈線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為7.81ng/mL。此方法具有快速、靈敏、特異的