牛乳鐵蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：以牛乳鐵蛋白為抗原，通過動(dòng)物免疫、間接ELISA方法建立、細(xì)胞融合、陽性克隆篩選、亞克隆等步驟，獲得能分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，并制備、純化腹水，進(jìn)行效價(jià)和特異性鑒定，以獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆細(xì)胞株，為下一步研制BLF檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法：結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的具體情況，將一定量牛乳鐵蛋白與弗氏佐劑混合充分乳化，免疫BALB/c小鼠，100μg/只，共免疫4次(間隔2周)；采血測(cè)定血清抗體效價(jià)并建立間

2、接ELISA方法，待血清效價(jià)大于1:3000時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合。取血清效價(jià)高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合；使用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行篩選，陽性孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克?。旱玫降膯慰寺〖?xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大凍存及腹水制備。腹水進(jìn)行效價(jià)測(cè)定；使用試劑盒測(cè)定其抗體亞型，進(jìn)行抗體純化、純度及特異性檢測(cè)。 結(jié)果：4次免疫后小鼠抗體效價(jià)達(dá)到1:6400以上。以PEG1500進(jìn)行細(xì)胞融合，融合

3、孔為296孔，融合率達(dá)到77.08％。經(jīng)間接ELISA篩選，共得14個(gè)陽性孔，陽性率為3.65％。兩次亞克隆后得到兩株單克隆細(xì)胞株：3C9、4E11。經(jīng)腹水制備、效價(jià)檢測(cè)等試驗(yàn)，最終確定兩者抗體亞型均為IgG2b、k型，SDS-PAGE檢測(cè)純度較高。將純化單抗與牛乳中酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白進(jìn)行交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，表明兩株細(xì)胞分泌的單抗特異性較好。 結(jié)論：以牛乳鐵蛋白為抗原，通過動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、