豬偽狂犬病病毒gB蛋白B細胞表位解析及其阻斷ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬、牛、羊等多種哺乳動物的重要傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。目前，疫苗免疫成為防控偽狂犬病的主要手段。但是，2011年以來，我國許多規(guī)?；i場再次出現PRV大流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重經濟損失。本研究從我國發(fā)病豬場分離得到1株PRV強毒株，采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達獲得的PRV超強毒株2J01gB和gE重組蛋白，制

2、備獲得4株抗PRV單克隆抗體，闡明了gB蛋白一個抗原表位，采用重組gB蛋白和辣根過氧化物酶標記的gB蛋白單抗，成功建立了檢測PRV抗體的阻斷ELISA方法，為該病防控奠定了重要基礎。具體研究內容包括:
　　1.江蘇省豬偽狂犬病病毒強毒株分離與致病性研究
　　從臨床發(fā)病豬群分離獲得一株PRVNJ毒株，gC和gD基因推導的氨基酸序列與先前報道的毒株相比分別有7個與2個氨基酸的插入，基因進化樹結果顯示，該分離株位于相對獨立的分支，

3、與亞洲分離株親緣關系較近。100日齡健康豬攻毒比較結果顯示，PRVNJ株滴鼻接種組豬出現明顯臨床癥狀，攻毒后7d內全部死亡，組織病理變化明顯，而傳統(tǒng)毒株LA接種組僅表現體溫變化與輕微呼吸道癥狀，組織病理變化輕微，表明PRV NJ分離毒株毒力明顯增強。
　　2.豬偽狂犬病病毒gB和gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
　　本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達獲得PRV超強毒株ZJ01 gB和gE重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合

4、、克隆和間接ELISA方法篩選，制備獲得4株能穩(wěn)定分泌抗PRV單克隆抗體的雜交瘤細胞，細胞培養(yǎng)上清ELISA抗體效價為1∶1600～6400，腹水抗體效價達1∶4×105;連續(xù)培養(yǎng)20代，抗體效價基本一致。抗gB單抗B1B6和B3D7屬于IgG2b，抗gE單抗E1B11和E5C10屬于IgG1，輕鏈均為κ型。Western blot和IFA結果顯示，4株單抗均能與PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ和LA發(fā)生特異性反應，B1B6和B

5、3D7還能與PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61發(fā)生反應，但E1B11和E5C10b不能與Bartha-K61反應，為PRV功能蛋白和抗體鑒別診斷試劑盒研制奠定了重要基礎，
　　3.豬偽狂犬病毒ZJ01毒株gB蛋白單克隆抗體的B細胞表位鑒定
　　為了對已獲得的2株抗PRV gB蛋白的單克隆抗體針對的抗原表位進行定位，本研究利用原核表達系統(tǒng)截斷表達了7個重組gB蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot鑒

6、定目的蛋白成功表達后，再通過Western blot對2株抗PRVgB蛋白的單克隆抗體所識別的抗原表位進行定位。結果顯示，抗gB單抗B1B6和B3D7識別相同的抗原表位E(104) YGDLDART(112)，與不同來源的PRV毒株進行序列比對分析，結果發(fā)現該表位在所參考毒株中高度保守。本研究為gB蛋白功能分析研究和PRV診斷方法的建立奠定了基礎。
　　4.豬鑄狂犬病病毒阻斷ELISA抗體檢測方法的建立與應用
　　本研究采用

7、豬偽狂犬病毒(PRV)ZJ01毒株重組gB蛋白和HRP標記單克隆抗體，建立檢測PRV gB抗體的阻斷ELISA方法，其優(yōu)化的反應條件為:抗原包被濃度0.5μg·mL-1，待檢血清1∶1稀釋，作用時間37℃1h，酶標單抗稀釋度為1∶15000，作用時間為37℃0.5h。血清樣品阻斷率PI≥28.67％時判為陽性，PI≤18.27％時判為陰性，18.27％＜PI＜28.67％時判為可疑。該方法與PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV抗體陽