豬嗜血支原體MSG1蛋白B細(xì)胞表位的解析及雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf

1、豬嗜血支原體（Mycoplasmassuis/M.suis）又稱豬附紅細(xì)胞體(porcineeperythrozoon/PE)，是傳染性貧血?。↖nfectiousanemia）的病原體，危害全球養(yǎng)豬業(yè)。目前豬嗜血支原體被鑒定出至少有8種病原蛋白，其中MSG1蛋白黏附紅細(xì)胞和糖酵解的功能，被認(rèn)為是重要的病原蛋白。本研究成功制備5株抗MSG1蛋白的單克隆抗體，并鑒定獲得的3個(gè)表位（251-255aa，268-274aa，291-299aa

2、）。為豬嗜血支原體表位疫苗研究奠定重要基礎(chǔ)。本研究同時(shí)還利用制備的單克隆抗體建立了MSG1蛋白雙抗體夾心ELISA方法，有望為建立豬嗜血支原體的快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容主要分為以下3部分:
　　1.豬嗜血支原體MSG1蛋白單克隆抗體的制備
　　以實(shí)驗(yàn)室保存的含豬嗜血支原體msg1基因的重組質(zhì)粒pBAD/His-msg1轉(zhuǎn)化至宿主菌Top10中，并誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組MSG1蛋白。將純化的重組蛋白MSG1與等量的

3、弗氏佐劑混合乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠。取抗體檢測(cè)陽(yáng)性的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)間接ELISA方法篩選出5株能穩(wěn)定分泌抗豬嗜血支原體MSG1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為:1C10、2D8、2F10、4G10和10E9。Westernblot結(jié)果顯示5株單克隆抗體均能夠特異性地識(shí)別重組MSG1蛋白。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果證明5株單克隆抗體均能夠與天然豬嗜血支原體發(fā)生特異性反應(yīng)?？关i嗜血支原體MSG1蛋白單

4、克隆抗體的制備成功，為免疫診斷試劑盒制備和抗原表位的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.豬嗜血支原體MSG1蛋白B細(xì)胞表位的解析
　　為了精確定位豬嗜血支原體MSG1蛋白單克隆抗體識(shí)別的B細(xì)胞表位，以重組質(zhì)粒pBAD/His-msg1為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增23個(gè)截短msg1基因片段，克隆至pET-32a載體，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)這23個(gè)重組截短的蛋白。通過(guò)間接ELISA和Westernblot方法精確定位四株單克隆抗體識(shí)別的表位

5、，結(jié)果顯示:單抗4G10和10E9能夠識(shí)別的位點(diǎn)是I(268)KDGENE(274)，單抗1C10識(shí)別的位點(diǎn)為D(291)THGSVF(297)，單抗2F10識(shí)別的位點(diǎn)為L(zhǎng)(251)CLKI(255)，三個(gè)表位均為線性表位。以上結(jié)果豐富了豬嗜血支原體MSG1抗原表位圖譜，為進(jìn)一步研究MSG1蛋白的相關(guān)功能奠定一定的基礎(chǔ)。
　　3.豬嗜血支原體MSG1蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立
　　為建立方便快捷的豬嗜血支原體檢測(cè)方法

6、，本研究以原核表達(dá)的MSG1蛋白制備的單克隆抗體2F10作為包被抗體，酶標(biāo)單克隆抗體1A7-HRP為檢測(cè)抗體，建立MSG1蛋白雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法的最佳工作條件為:抗MSG1蛋白MAb2F10的包被濃度為4μg/mL，1A7-HRP的稀釋度為1∶500。該ELISA方法對(duì)豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌均無(wú)交叉反應(yīng);敏感度可達(dá)0.0625μg/mL;其重復(fù)性變異系數(shù)小于10％。本實(shí)驗(yàn)建立的MSG1雙抗體夾心ELISA檢測(cè)