定量檢測ProMBP雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf

1、背景：嗜酸性主要堿性蛋白前體(Profom of eosinophil major basic protein，ProMBP)是嗜酸性粒細胞特殊顆粒中含量最豐富的蛋白質，即主要堿性蛋白(Major basic protein，MBP)的前體，其主要在嗜酸性粒細胞的前體細胞中表達；此外，胎盤的X細胞也可以合成ProMBP并分泌到母體血液循環(huán)中[1].ProMBP是一種高度糖基化的蛋白質，由206個氨基酸殘基組成，等電點為6.0[2]，分子

2、量50～90 ku，因其高度糖基化，SDS-PAGE后，行考馬斯亮藍染色幾乎不可見[3]。ProMBP在母體血液循環(huán)中與三種重要的生物活性分子結合以復合物的形式存在[4]：與PAPP-A以二硫鍵結合，形成2:2異源四聚體，分子量500 ku；與血管緊張素原以二硫鍵結合，形成2:2異源四聚體，分子200 ku；與血管緊張素原和補體C3dg以二硫鍵結合，形成2:2:2異源六聚體，分子量280 ku。有報道認為ProMBP可以作為篩查唐氏綜合

3、征(Down Syndrome，Ds)的一項有效的血清學指標[5-7].妊娠早期，其水平是逐漸升高的，妊娠中期達峰值[3]，另外，正常非孕婦女血清中也可檢測到ProMBP[3]。目前，國外檢測ProMBP的主要方法是ELISA測定[6]以及免疫放射測定[8]，但國內(nèi)尚沒有這方面的報道。 目的：純化、鑒定和標記抗ProMBP單克隆抗體(mAb)以及建立定量檢測ProMBP的雙抗體夾心ELISA方法。 方法：采用Protei

4、n A親和層析法純化本室制備的抗ProMBP mAb，并行SDS-PAGE和Western-blotting對純化抗體特性進行鑒定；利用簡易過碘酸鈉法對抗ProMBP mAb進行標記HRP后行抗體配對實驗；通過方陣滴定法確定包被抗體和酶標抗體的最適工作濃度；以純化的PAPP-A/ProMBP抗原為標準品建立標準曲線；以重復性、靈敏性、回收性實驗和交叉反應評價ELISA方法。初步對人血清中的ProMBP水平進行檢測。 結果：最佳配

5、對組合為抗ProMBP mAb 4C6E5B9和HRP標記的抗ProMBP mAb 9G4A6G10，最適工作濃度分別為2.5μg/ml和1:3000，該方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為4.6％～6.2％和4.6％～10.5％，靈敏度達2.0 ng/ml，回收率為92％～113％，與所測蛋白無交叉反應。正常非妊娠血清、9～11周妊娠血清、15～17周妊娠血清ProMBP水平分別為(26.37±2.90)ng/ml、(357.71±33.6