雙抗體夾心ELISA檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒方法的建立.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)可引起雞的一種急性、高度接觸傳染性的呼吸道和泌尿生殖道疾病—雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)。自1931年被首次報(bào)道后，IB在世界各地均有發(fā)生，IBV現(xiàn)已衍生出多種血清型。IBV可與其它病原體混合感染，引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大損失。IBV抗原性復(fù)雜，易發(fā)生基因重組和點(diǎn)突變，而且不同血清型間的交叉保護(hù)效力低，使

2、IB的防控極具挑戰(zhàn)性，因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速的診斷方法，對(duì)IB的防控非常重要。核衣殼蛋白（N蛋白）是IBV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，相對(duì)較保守，本研究針對(duì)N蛋白制備了兔多克隆抗體(PcAb)和鼠單克隆抗體(MAb)，建立了檢測(cè)IBV的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，為IBV的診斷提供了一種行之有效的手段。
　　1.針對(duì)IBV N蛋白的兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體的制備
　　本研究以IBV QXL毒株為基礎(chǔ)，對(duì)其N(xiāo)蛋白的序列進(jìn)行抗原性分析，用

3、PCR方法擴(kuò)增抗原性較強(qiáng)區(qū)域?qū)?yīng)的N基因片段，然后將產(chǎn)物連至克隆載體上，經(jīng)基因測(cè)序鑒定正確后，再以pET-32a(+)為載體，構(gòu)建表達(dá)N蛋白片段的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得的N蛋白片段用作免疫原，分別免疫成年兔和6-8周齡的BALB/C小鼠。當(dāng)免疫兔的血清效價(jià)達(dá)到1∶104時(shí)，心臟采血制備抗N蛋白的PcAb血清;當(dāng)免疫鼠的血清效價(jià)達(dá)到1∶104時(shí)，取脾臟與SP2/0細(xì)胞融合，利用間接ELISA鑒

4、定、篩選雜交瘤細(xì)胞，最終獲得四株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白MAb的細(xì)胞株6F4、7D8、3G2、5C9，制備腹水并鑒定、純化后，進(jìn)一步用Western blot鑒定，結(jié)果表明獲得的單抗可與N蛋白特異結(jié)合。
　　2.檢測(cè)IBV的雙抗體夾心ELISA方法的建立
　　本研究以制備的PcAb為包被抗體、MAb為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)IBV的雙抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:包被抗體最佳稀釋度為1∶64000，檢測(cè)抗體最佳稀釋度為1∶

5、4000，封閉液為1％B SA-PBST，酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶10000，顯色底物作用時(shí)間為15 min。特異性實(shí)驗(yàn)表明，該方法對(duì)禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)及禽腺病毒(FAdV)無(wú)交叉反應(yīng)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，該方法的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于8％。該方法與檢測(cè)IBV的PCR方法的陽(yáng)性符合率為95.9％，陰性符合率為85.2％。
　　總之，本研究制備的抗體可以和IBV的N蛋白特異性反應(yīng)，以此為基礎(chǔ)建立的雙抗體夾心ELIS