豬細小病毒ELISA抗體檢測方法的初步建立.pdf

1、豬細小病毒病是由豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）引起的一種母豬繁殖障礙性疾病。該病引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及延遲發(fā)情等，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。雖然豬細小病毒疫苗已得到廣泛使用，但豬群中的抗體監(jiān)測仍十分重要。本研究旨在表達、純化、篩選診斷抗原，并以此初步建立豬細小病毒ELISA抗體檢測方法。
　　具體內容如下：
　　1.PPV ELISA抗體檢測方法包被抗原的篩選
　　為篩選良好的包

2、被抗原，本研究共構建了4種豬細小病毒VP2重組原核表達質粒：VP2-pGEX-KG、VP2-pET-28a-sumo、VP2(469-1316bp)-pGEX-KG、VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo，并分別在大腸桿菌中進行了表達、純化。通過SDS-PAGE分析、血凝活性的檢測及方陣滴定后，選擇了 VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo重組蛋白作為PPV ELISA抗體檢測方法的包被抗原，并確定其

3、最佳包被量為101.6 ng/孔。
　　2.PPV ELISA抗體檢測方法的初步建立
　　以 VP2(469-1316bp)-pET-28a-sumo重組蛋白作為包被抗原，進行了一系列ELISA條件的摸索，確定了最佳封閉液為0.5％牛血清白蛋白，最佳樣品稀釋液為含0.5%BSA+0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，酶標二抗最佳稀釋度為1:5000，血清、酶標二抗、底物的最佳孵育時間分別為30min、60min及30mi

4、n，判定標準定為樣品S/P≥0.38為陽性，S/P<0.38為陰性。
　　3.PPV ELISA抗體檢測方法的初步評價
　　以HI試驗檢測一批臨床血清并確定其血凝抑制效價，并將該批血清作為標準血清，對建立的ELISA方法進行評價。結果表明，建立的ELISA方法敏感性良好，批內重復變異系數(shù)為5.32%-14.58%，批間重復變異系數(shù)為2.89%-11.52%，與HI試驗的陽性符合率為100%，陰性符合率為30%，總符合率為72