豬圓環(huán)病毒Ⅱ型和豬瘟病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立與初步應用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovius，PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，基因分型表明PCV分為兩個基因型，PK15細胞源性無致病性的PCV規(guī)定為PCV1,感染斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合癥（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的豬中分離的具有致病性的規(guī)定為PCV2,PCV2被認為是導致PMWS的病原，感染PMWS的豬會出現(xiàn)生長障礙、呼吸困難、皮膚蒼白或黃疸、瀉痢等癥狀。該

2、病1991年在加拿大首次被報道，現(xiàn)在已經(jīng)遍布世界各地的產(chǎn)豬地區(qū)。
　　 豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的高度接觸性傳染病，以出血和發(fā)熱為主要特征，呈急性、亞急性或慢性經(jīng)過。豬瘟病毒為黃病毒科（Flaviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員。臨床表現(xiàn)的多變和強毒株的出現(xiàn)均會導致高發(fā)病率和死亡率。亞急性和慢

3、性豬瘟由于癥狀不明顯不能被迅速檢測而造成病毒的散播。豬瘟間歇性的暴發(fā)給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 PCV2的核衣殼蛋白（Capsid，Cap）和CSFV的囊膜蛋白E2在感染動物體內可以誘導產(chǎn)生保護性免疫，同時病毒感染機體后主要產(chǎn)生針對這兩種結構蛋白的抗體。因此，這兩種蛋白被認為是間接ELISA包被抗原的首選。
　　 本論文的試驗由兩個部分組成：
　　 一、Cap蛋白和E2蛋白分別利用pET表達系統(tǒng)在

4、大腸桿菌中的表達。
　　 二、用這兩種蛋白為抗原分別建立檢測PCV2-Cap抗體和CSFV-E2抗體的間接ELISA方法，并對臨床血清樣品進行檢測。
　　 主要結果如下：
　　 1.用PCR方法從PCV2 HBZX株中獲得截短的Cap基因，將該基因定向克隆到原核表達載體pET-32a（+）中，將鑒定正確的重組質粒命名為pET-Cap，然后轉化宿主菌E.coli BL21-codonplus（DE3），SDS-PA

5、GE和Western-blot鑒定蛋白的正確表達，表達蛋白Cap分子量為42kDa。
　　 用RT-PCR方法從CSFV Shimen株中獲得E2囊膜糖蛋白A-D抗原區(qū)基因，將該基因定向克隆到原核表達載體pET-32a（+）中，構建重組表達質粒pET-E2,將鑒定正確的陽性重組質粒轉化宿主菌E.coli BL21-codonplus（DE3），SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達蛋白E2分子量約為38.6kDa。<

6、br>　　 2.用表達的Cap蛋白作為包被抗原建立PCV2抗體間接ELISA方法。通過反應條件的優(yōu)化得出抗原包被濃度為3μg/mL；一抗稀釋度為1：400，作用時間為45min；二抗作用時間為60min；陰陽性血清的臨界值分別為0.158和0.188。用該方法分別檢測湖北、河南等地的91份臨床血清樣品，陽性率為25％～100％。說明兩地已有PCV2感染。
　　 用表達的E2蛋白作為包被抗原建立CSFV抗體間接ELISA方法。通

7、過反應條件的優(yōu)化得出抗原包被濃度為3μg/mL；一抗稀釋度為1：100，作用時間為45min；二抗作用時間為60min；陰陽性血清的臨界值分別為0.839和1.004。用該方法檢測湖北武漢331份豬血清，檢測結果與進口試劑盒比較，陽性率分別為41.1％和67.1％。共陽性為111份，共陰性為41份。符合率為45.9％。符合率較低的原因可能與兩種方法包被抗原的不同有關。
　　 結果表明，所建立的間接ELISA方法能夠分別檢測出豬血