豬圓環(huán)病毒Ⅱ型核酸疫苗的構(gòu)建及間接ELISA方法的建立.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型DNA疫苗的構(gòu)建及對小鼠的免疫效果
　　 目的：以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF2為基礎(chǔ)，構(gòu)建豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus2，PCV2）FZ0502株ORF2 DNA核酸疫苗，并評價(jià)其免疫效果和安全性。
　　 方法：應(yīng)用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF2與真核表達(dá)載體PcDNA3.1在同等條件下進(jìn)行雙酶切，并通過T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α經(jīng)37℃培養(yǎng)

2、并挑取生長的菌落通過搖菌大量提取其質(zhì)粒；應(yīng)用BamH和xhoI雙酶切技術(shù)，鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒；應(yīng)用無內(nèi)毒素提取質(zhì)粒試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，經(jīng)過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染單層的Vero細(xì)胞，37℃于CO2培養(yǎng)箱維持培養(yǎng)4d后，提取Vero細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR方法鑒定ORF2基因的表達(dá)情況；將陽性重組質(zhì)粒腿部肌肉注射免疫Balb/c小鼠（100μg/只），同時(shí)設(shè)PBS和PcDNA3.1空載體為對照，間隔2

3、周加強(qiáng)免疫1次。分別于首免后第14d和第28d采血，用ELISA方法檢測血清抗體；取首免后第56d小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦等實(shí)質(zhì)器官，采用PCR方法檢測該核酸疫苗的安全性。
　　 結(jié)果：pMD18-T-ORF2與真核載體PcDNA3.1經(jīng)雙酶切連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α并克隆，質(zhì)粒用雙酶切鑒定，結(jié)果顯示582bp目的條帶，陽性質(zhì)粒命名為PcDNA3.1-ORF2。經(jīng)過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染單層的

4、Vero細(xì)胞，提取Vero細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法鑒定ORF2基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在582bp位置出現(xiàn)了目的條帶。間接ELISA方法檢測免疫小鼠的PCV2抗體，核酸疫苗PcDNA3.1-ORF2誘導(dǎo)的PCV2抗體明顯高于PBS和PcDNA3.1誘導(dǎo)的PCV2抗體；首免56d后，采集小鼠的器官經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，均沒有擴(kuò)增出PCV2-ORF2的目的條帶。
　　 結(jié)論：成功地構(gòu)建了PcDNA3.1-ORF2核酸疫苗，在體外

5、Vero細(xì)胞中得到了瞬時(shí)表達(dá)，并且能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答；安全性試驗(yàn)表明該核酸疫苗未整合到小鼠染色體上，是安全的。
　　 實(shí)驗(yàn)二豬圓環(huán)病毒Ⅱ型間接ELSIA診斷方法的建立
　　 目的：利用原核表達(dá)載體PGEX-6P-1表達(dá)棄掉信號肽的ORF2基因，將表達(dá)的PCV2-Cap蛋白包被酶標(biāo)板，建立一種特異、快速、敏感的間接ELISA方法。
　　 方法：培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒PGEX-6P-ORF2的大腸桿菌BL21，并

6、用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎，提純包涵體；通過稀釋包涵體和二抗，用方陣滴定法確定抗原最適包被濃度和兔抗豬IgG最佳稀釋濃度；將待檢血清進(jìn)行倍比稀釋后，測定其OD490值，確定最佳血清稀釋度；用建立的間接ELISA方法與韓國JBT的PCV2試劑盒共同檢測20份陰性血清，以檢測的平均OD490值加3倍標(biāo)準(zhǔn)方差作為陰陽性的臨界值；用建立的間接ELISA方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒陽性血清，同時(shí)作PCV2

7、陽性血清和陰性血清對照，驗(yàn)證間接ELISA特異性；檢測三次16份PCV2陰陽性血清，每周檢測1次，并通過方差分析比較結(jié)果的差異性；與韓國JBT的PCV2試劑盒同時(shí)分別對40份陰陽性血清檢測，比較結(jié)果，并計(jì)算符合率；并對采集于福建省內(nèi)的福州、寧德、廈門、莆田等地區(qū)的204份血清樣品進(jìn)行檢測，評價(jià)檢測結(jié)果。
　　 結(jié)果：通過對間接ELISA方法反應(yīng)條件的摸索，確定了該間接ELISA方法的最佳包被抗原濃度和兔抗豬IgG稀釋度分別為1.

8、5μg/孔和1:3000；最佳血清稀釋度為1:400；陽性標(biāo)準(zhǔn)的臨界值應(yīng)大于0.427；對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、PCV2陽性血清和PCV2陰性血清進(jìn)行測定，只有PCV2陽性血清出現(xiàn)陽性結(jié)果；重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)問差異不顯著；與韓國JBT的PCV2試劑盒同時(shí)對陰性和陽性血清檢測結(jié)果進(jìn)行比較，陽性血清符合率為95％，陰性血清的符合率為90％，總符合率為92.5％；用建立的間接ELISA方法對采集福建省