豬乙型腦炎病毒的分離鑒定、致弱及間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、乙型腦炎是由日本腦炎病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的一種急性人畜共患病毒性腦炎。乙型腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，與西尼羅病毒、登革熱病毒同屬。該病毒可通過(guò)蚊子的叮咬傳播，三帶喙庫(kù)蚊是主要傳播媒介。人類感染乙腦后，死亡率在20％-50％，疾病治愈后多數(shù)幸存者存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。豬是JEV感染環(huán)節(jié)中重要的中間宿主、擴(kuò)增宿主，乙腦病毒可以導(dǎo)致母豬繁殖障礙、公豬睪丸炎，造成養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)研究表明，豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密

2、切相關(guān)，因此預(yù)防控制乙腦在豬群的流行不僅可以降低經(jīng)濟(jì)損失，也是防控人患乙腦的重要措施。
　　 因此本研究對(duì)于豬群中流行的乙腦病毒進(jìn)行了分離與鑒定、對(duì)乙型腦炎病毒致弱毒株的分子生物學(xué)特征進(jìn)行了研究;利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)JEV的主要抗原蛋白E蛋白和EDⅢ蛋白，構(gòu)建檢測(cè)抗體的間接ELISA方法，并對(duì)2010年上海地區(qū)部分豬場(chǎng)的乙腦流行情況進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查，為了解此病在豬群中流行情況，了解強(qiáng)毒株的致弱原因及病毒相關(guān)毒力區(qū)域，為建立

3、有效的流行病學(xué)檢測(cè)方法提供一定依據(jù)。研究的主要內(nèi)容主要如下:
　　 1.采用2日齡乳鼠腦內(nèi)接毒和BHK-21細(xì)胞接毒方法，從2009年收集的疑似發(fā)病豬的血液和公豬精液中分離得到6株能在細(xì)胞上產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變和引起小鼠神經(jīng)癥狀的乙腦病毒。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)及RT-PCR方法對(duì)上述6株病毒進(jìn)行鑒定，并將其PrM基因與標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行比較分析。6株分離毒株間接免疫熒光反應(yīng)呈現(xiàn)特異性熒光，與SA14-14-2株、北京-1株、P3

4、株、Whe株P(guān)rM蛋白的核苷酸的同源性均在96％以上，尤其與疫苗株SA14-14-2的同源性最高，這進(jìn)一步證實(shí)了分離的病毒確實(shí)為乙腦病毒，也驗(yàn)證了不同乙腦毒株間的PrM蛋白基因的保守性。
　　 2.利用Hela細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎NJ08株進(jìn)行傳代致弱，對(duì)于NJ08株及傳代后第50代次、100代次毒株，參考GenBank中乙腦病毒NJ08株的基因序列，利Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成針對(duì)JEVC蛋白、PrM蛋白與E蛋白基因的特異

5、性引物，對(duì)其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序鑒定。結(jié)果表明不同代次的C蛋白及PrM蛋白核苷酸及氨基酸序列的同源性達(dá)99％以上;而不同代次毒株的E蛋白核苷酸及氨基酸序列的保守性較差，50代次與100代次毒株E蛋白的核苷酸發(fā)生變異的區(qū)域集中于第1200-1280位間。其氨基酸序列改變的區(qū)域位于370aa-440aa間。從流行性乙型腦炎病毒E蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析，該區(qū)域位于E蛋白結(jié)構(gòu)上的C端跨膜區(qū)前的近膜區(qū)，該區(qū)域的改變可能導(dǎo)致病毒毒力的降低。

6、>　　 3.通過(guò)PCR擴(kuò)增出了流行性乙型腦炎強(qiáng)毒NJ08株E蛋白基因序列，連接到載體pColdⅠ中，成功構(gòu)建了E-pColdⅠ表達(dá)載體。將構(gòu)建好的E-pColdⅠ、EDⅢ-PET-28a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)親和層析柱純化獲得JEVE白及EDⅢ蛋白，純化后的E蛋白的濃度為300μg/ml，EDⅢ蛋白的濃度達(dá)到480μg/ml。經(jīng)Westenblot分析所表達(dá)的蛋白均可以與JEV陽(yáng)性抗體發(fā)生反應(yīng)。
　

7、　 4.以純化的重組E蛋白和EDⅢ蛋白分別作為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化各步反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)JEW抗體的間接ELISA方法。針對(duì)EDⅢ蛋白，最終確定抗原最適包被濃度為0.625μg/ml，針對(duì)E蛋白的的抗原最適包被濃度為1.875μg/ml，血清最佳稀釋度均為1∶40，陰陽(yáng)性臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)分別為(O)D450nm=0.333，(O)D450nm=0.454。兩種方法都具有良好的特異性、重復(fù)性，與商品化試劑盒也具有很高的符合率，可應(yīng)用于豬群

8、的流行性乙型腦炎的流行病學(xué)調(diào)查。
　　 5.以原核表達(dá)的JEVEDⅢ蛋白為包被抗原構(gòu)建的間接ELISA方法，對(duì)2010年從上海地區(qū)收集414份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，JEW抗體的陽(yáng)性率為68.69％。其中成年豬的血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)90.14％，仔豬的血清抗體陽(yáng)性率為37.50％。對(duì)4周齡至16周齡的仔豬抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗體水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。利用空斑減少試驗(yàn)對(duì)血清的病毒中和活性進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，顯示80％ELISA檢測(cè)為