豬巨細(xì)胞病毒gB蛋白間接ELISA方法的建立及單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬巨細(xì)胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)是一種有囊膜的雙股線性DNA病毒，可以導(dǎo)致胚胎死亡、仔豬鼻炎、矮小、肺炎和增重緩慢等癥狀，成年豬一般呈隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀。PCMV主要蛋白有糖蛋白B、衣殼蛋白和DNA聚合酶蛋白。gB蛋白是PCMV的必需糖蛋白和重要免疫原，在病毒侵染宿主細(xì)胞的黏附、融合和進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)gB蛋白作為主要的保護(hù)性抗原，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)

2、答。本研究通過(guò)基因重組技術(shù)獲得重組gB蛋白，將純化的gB蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，用于PCMV抗體的檢測(cè)和血清學(xué)調(diào)查。同時(shí)，將gB蛋白免疫小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備gB蛋白的單克隆抗體，為PCMV診斷和致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:
　　1.豬巨細(xì)胞病毒gB基因原核表達(dá)與鑒定
　　采用PCR方法從PCMV陽(yáng)性組織病料中擴(kuò)增gB基因，將其克隆至pET-32a載體。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(

3、DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板挑選陽(yáng)性單個(gè)克隆菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為40KDa。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blotting分析，表達(dá)的蛋白能夠與His-Tag單克隆抗體反應(yīng)，也能被豬抗PCMV-gB蛋白血清所識(shí)別。試驗(yàn)結(jié)果表明，PCMV-gB基因在大腸桿菌中高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性。
　　2.豬巨細(xì)胞病毒間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用
　　用純化的gB蛋白包被E

4、LISA酶標(biāo)板，建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并確定其臨界值，同時(shí)進(jìn)行特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)。優(yōu)化反應(yīng)條件為:抗原最適包被量為0.4μg/ml,待檢血清稀釋度為1∶100，37℃作用1h，包被時(shí)間為37℃作用2h，然后4℃過(guò)夜，5％脫脂乳37℃封閉2h，二抗1∶10000稀釋?zhuān)?7℃作用1h，臨界值為OD450nm≥0.354判為陽(yáng)性，OD450nm≤0.295判為陰性，介于二者之間為可疑。與豬瘟，豬偽狂犬

5、病，豬附紅細(xì)胞體病，副豬嗜血桿菌及豬2型圓環(huán)病毒等血清抗體無(wú)交叉反應(yīng)，批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)較好，對(duì)江蘇省259份仔豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率達(dá)56.76％，為PCMV診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效工具。
　　3.抗豬巨細(xì)胞病毒gB蛋白單克隆抗體的研制
　　以原核表達(dá)的重組豬巨細(xì)胞病毒gB蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，間接ELISA抗體方法篩選，獲得了8株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6C2、6

6、H9、8B5、1E7、3C9、3F6、3F11和5G10。其細(xì)胞上清ELISA抗體效價(jià)為1∶800～1∶3200，腹水效價(jià)為1∶2.048×105～1∶8.196×106;單抗的亞類(lèi)鑒定結(jié)果為:6C2、6H9和8B5為IgG2b亞類(lèi)，1E7、3C9、3F6、3F11和5G10均為IgG1亞類(lèi)，8株單抗輕鏈均為κ型;Western-blotting鑒定表明獲得8株單克隆抗體能夠與原核表達(dá)的gB蛋白反應(yīng)，但是只有6C2和6H9兩株單抗能夠識(shí)