強(qiáng)力霉素單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DC）為廣譜、半合成的四環(huán)素類抗生素，應(yīng)用于家畜及家禽等動(dòng)物性傳染性疾病的預(yù)防和治療，以及飼料添加劑的使用。在實(shí)際應(yīng)用中，由于不規(guī)范用藥，導(dǎo)致強(qiáng)力霉素在動(dòng)物組織及副產(chǎn)品中殘留，危害食品安全及人類健康。
　　檢測(cè)強(qiáng)力霉素殘留可采用儀器檢測(cè)法，主要包括高效液相色譜檢測(cè)方法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法、薄層色譜檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)法需要貴重的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣品前期處理過(guò)程、專業(yè)很高的技術(shù)人員，存在

2、的這些不利因素導(dǎo)致上述檢測(cè)方法在實(shí)際生產(chǎn)中不適合大量的樣品檢測(cè)。微生物檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)同時(shí)特異性較差，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。ELISA檢測(cè)方法在抗原抗體反應(yīng)的基礎(chǔ)上，特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、高效、靈活，便于攜帶，適合在現(xiàn)場(chǎng)大批量的樣品快速篩選。
　　本實(shí)驗(yàn)采用偶氮苯甲酸-碳二亞胺法合成強(qiáng)力霉素完全抗原，經(jīng)過(guò)透析、紫外掃描等鑒定后免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用雜交瘤單克隆抗體、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)及制取單抗腹水

3、等技術(shù)，制備出針對(duì)強(qiáng)力霉素特異性強(qiáng)、效價(jià)高的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立檢測(cè)強(qiáng)力霉素殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。
　　1.DC完全抗原的合成與鑒定
　　DC屬于半合成四環(huán)素類藥物，是氫化并四苯衍生物，其分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，通過(guò)偶氮苯甲酸法，改造DC分子，再利用碳二亞胺法將其與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)起來(lái)，形成穩(wěn)固的分子間隔臂以及酰胺鍵，即為合成完全抗原。完全抗原經(jīng)過(guò)紫外光譜掃描法通過(guò)紫外波峰的偏移情況，初步判定DC與載

4、體蛋白分子偶聯(lián)成功。完全抗原經(jīng)過(guò)一系列的免疫、細(xì)胞融合及ELISA檢測(cè)方法的鑒定，最終判定兩種完全抗原制備成功。利用BCA法測(cè)得DC-BSA及DC-OVA的蛋白濃度分別是2.9mg/mL和2.8mg/mL。
　　2.DC單克隆抗體制備
　　本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的免疫方案免疫雌性BALB/c小鼠，將DC-BSA作為免疫原，以DC-OVA為包被原。五次免疫后第7d小鼠尾靜脈采血，檢測(cè)得血清效價(jià)達(dá)1∶10000以上。小鼠在加強(qiáng)免疫3d后

5、，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)、酶聯(lián)免疫篩選方法及亞克隆有限稀釋法，最后獲得兩株可持續(xù)分泌抗DC的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6C9和1H8。將6C9和1H8兩株細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法分別制備兩種腹水，效價(jià)分別為1∶200000和1∶160000，其蛋白濃度分別為31.6mg/mL和25.2mg/mL。
　　3.ELISA檢測(cè)方法的建立
　　利用純化后的6C9單克隆抗體，建立檢測(cè)DC藥物殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELI

6、SA方法。包被原最佳稀釋濃度1∶3000，6C9抗體的最佳工作濃度1∶32000，利用DC制作藥物競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性方程為y=0.346x-0.212(R2=0.987)，IC50為126.5ng/mL，LOD低于10ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，6C9單克隆抗體對(duì)DC的抑制率為100％，與四環(huán)素的交叉反應(yīng)率為26.6％、與土霉素的交叉反應(yīng)率為14.8％、與金霉素?zé)o交叉反應(yīng)。
　　4.豬肉中DC添加回收實(shí)驗(yàn)<

7、br>　　將建立的檢測(cè)DC殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法用于豬肉中的添加回收實(shí)驗(yàn)，豬肉樣品需要經(jīng)過(guò)前期處理后用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)樣品處理液稀釋8倍以上時(shí)，基本消除樣品的基質(zhì)干擾。在5～1000ng/mL范圍內(nèi)，曲線標(biāo)準(zhǔn)方程:y=0.308x-0.132，R2=0.967，IC50為123.6ng/mL，LOD低于6ng/mL。用5、200、1000ng/mL的強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)液做添加回收實(shí)驗(yàn)，經(jīng)檢測(cè)豬肉樣品回收率在80％～98％之間。