豬圓環(huán)病毒型疫苗研究進(jìn)展

1、豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進(jìn)展,匯報人：趙微,目錄,,,,,,豬圓環(huán)病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)影響性疾病，也是我國養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病之一，與豬瘟和豬藍(lán)耳病并稱我國養(yǎng)豬業(yè)的三座大山。,,PMWS,PCVAD,,,,目前，對于豬2型圓環(huán)病毒（ＰＣＶ２）造成的相關(guān)疾病尚無有效的治療措施，而且圓環(huán)病毒對各種消毒劑都有很強(qiáng)的抵抗性，豬場難將其凈化，預(yù)防該病的首要方案是采用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。,,PCV2 屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是一種共價閉合

2、、單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，呈二十面體對稱，無囊膜。PCV2 病毒粒子直徑為17nm ，基因組大小約1.7kb ，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。PCV2 的基因組結(jié)構(gòu)存在11 個開放閱讀框(ORFs)，即ORF1-ORF11 ，ORFs 之間大小相差懸殊，所編碼的蛋白大小在2～36ku 。ORF1 與ORF2 是PCV2 最大的２個開放閱讀框，分別編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白Ｒep和Ｒep’以及病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ｃap。,,,,Ｃap 蛋白作為病毒

3、的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，是PCV2 的主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2 基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。ORF3 為病毒復(fù)制的非必需基因，其編碼的蛋白可誘導(dǎo)PCV2 感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡。許多學(xué)者在PCV2 基因組結(jié)構(gòu)與功能方面開展了大量研究，除ORF1 ,ORF2 與ORF3 的功能研究較為透徹外，其他ORFs 的功能尚不十分清楚。,,目前，國際上統(tǒng)一將PCV2 分為PCV2a、PCV2b、

4、PCV2c 三個基因亞型，其中PCV2a 和PCV2b 是目前存在的主要基因型，PCV2a 僅分離自無PMWS感染豬場，PCV2b 多分離自PMWS發(fā)生的豬群，PCV2c亞型毒株僅在20世紀(jì)80年代于丹麥分離，在致病性方面未見報道。PCV2在世界范圍內(nèi)廣泛分布并且在豬群中存在至少有50多年，血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查己證實全世界范圍內(nèi)許多國家和地區(qū)的豬群均存在PCV2感染，幾乎100%的商品化養(yǎng)豬場感染過PCV2，嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。,,

5、目前對該病毒的防控主要依靠疫苗，滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒滅活疫苗已投入使用，核酸疫苗、活載體疫苗和標(biāo)記疫苗等新型疫苗已成為PCV2 疫苗研究的熱點。,PCV2 國外流行情況,,,2003 2008,Olvera,PCV2a,PCV2b,,,,,,,Dupont 等對GenBank 中1997 年至2006 年間上傳的218 個PCV2 全基因組進(jìn)行遺傳

6、進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2003 年前豬群中主要流行PCV2a ,之后世界范圍內(nèi)豬群PCV2 感染存在轉(zhuǎn)型趨勢，主要以PCV2b 基因型流行為主，同時PCVAD 臨床表現(xiàn)較2003 年之前更為嚴(yán)重，但是這些國家不包括韓國、日本和澳大利亞。,,基于以上研究，Tanja Oprissnig 等分析了1996 - 2013 年間分離自美國和加拿大的750 份樣品，1996 - 2004 年間分離到的毒株均屬于PCV2a 基因型，2005 年出現(xiàn)新基

7、因型PCV2b ,2006 - 2013 年的流行株為PCV2b 基因型。,,2012年５月，美國在一PCV2 免疫失敗豬場首次分離到毒力均強(qiáng)于PCV2a 和PCV2b 的突變毒株(Mutant porcine circovirus type 2b,ｍPCV2b），由于美國商品化疫苗基于PCV2a 基因型，ｍPCV2b 毒株的發(fā)現(xiàn)讓人們更加關(guān)注當(dāng)前PCV2a 型疫苗的免疫效果。,,北美地區(qū)在2004 年前僅流行PCV2a 基因型,200

8、5 年爆發(fā)嚴(yán)重的PCVAD,PCV2b 基因型替代PCV2a 型在北美地區(qū)商業(yè)化豬場迅速蔓延，引起高發(fā)病率和死亡率。隨后在中國、泰國、韓國、丹麥、瑞士也相繼報道了PCV2b 基因型的出現(xiàn)，并在一段時間內(nèi)與PCV2a 基因型循環(huán)流行。,,2007 年Chae 等在韓國分離到36 株P(guān)CV2(PCVAD 發(fā)病豬場分離到29 株，PCVAD 未發(fā)病豬場９株)，29 株均屬于PCV2b，PCVAD 未發(fā)病豬場中有4 株屬于PCV2b。2006-

9、2007 年間，日本存在PCV2a 與PCV2b 兩種亞型，但是以PCV2b 為主要流行基因型。,,目前，PCV2b 基因型替代PCV2a 型成為優(yōu)勢基因型，有關(guān)PCV2 流行毒株遺傳變異的報道也逐漸增多，在遺傳變異及免疫壓力下可能出現(xiàn)其它形式的突變毒株。2008 年Ｈess等報道了PCV2a 與PCV2b 重組毒株，隨后有關(guān)不同PCV2b 毒株之間以及PCV1 與PCV2a 之間毒株發(fā)生基因重組相繼報道。同時進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組毒有很

10、高的體外繁殖能力，且抗原性發(fā)生改變，這些改變對致病性的影響有待進(jìn)一步研究。,,PCV2 基因型的漂移最早起源于歐洲，發(fā)生于2003 年或更早時間，北美洲和亞洲約發(fā)生于2005 年，大洋洲發(fā)生這種優(yōu)勢流行株轉(zhuǎn)變約在2006 年，時間上均比歐洲PCV2 基因型的改變有輕微的推遲，潛在原因還未得到證實，可能與進(jìn)口處于該病潛伏期的動物有關(guān)?；蛐桶l(fā)生漂移的同時伴隨著嚴(yán)重的圓環(huán)病毒病的爆發(fā)，雖然現(xiàn)有數(shù)據(jù)不能直接證明這些爆發(fā)是由PCV2b 毒株導(dǎo)致

11、，但是時間和地點上的巧合推測PCV2 主導(dǎo)型的變化與PCVAD 的發(fā)生存在很大關(guān)系，而基因型轉(zhuǎn)變的原因與機(jī)制目前尚不清楚。相對于PCV2 遺傳變異，PCV2 自然重組變異的報道比較少，其重組與病毒致病性和遺傳進(jìn)化的關(guān)系尚不明確。,我國PCV2 流行情況,Ｗang等從全國分離到49 株P(guān)CV2 ，其中2001 年分離到３株均屬于PCV2a 型，2002-2006 年分離到34 株P(guān)CV2 中PCV2b 有18 株，2007-2008 年

12、間分離到12 株均為PCV2b 型。Li 對2001-2009 年間分離自我國東部的136 株P(guān)CV2 進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，PCV2b 有127 株，PCV2a 僅有9 株，其中8 株P(guān)CV2a 分離自2001-2005 年間，從2005年以后，幾乎所有的分離株都是PCV2b 型，PCV2a 型越來越少，中國東部地區(qū)PCV2 流行毒株存在由PCV2a 向PCV2b 漂移的現(xiàn)象。,,王佳慧利用PCR 方法對中國16 個省市75 個規(guī)模化

13、豬場2010-2011 年間的688 份樣品進(jìn)行檢測，被檢豬場PCV2 陽性率為58.67% ,共分離到53 株P(guān)CV2 ,與GenBank下載的192 株中國分離株進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，53 株P(guān)CV2 中PCV2b 基因型有50 株,且2001 年前我國優(yōu)勢PCV2 基因型為PCV2a 型,2002 年之后流行的PCV2 基因型轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b 型,但同期仍有PCV2a 型毒株存在。,,趙英杰對2011-2012 年間采集自我

14、國18 個省市932 份樣品分析發(fā)現(xiàn)，2011-2012 年我國主要養(yǎng)豬地區(qū)規(guī)?；i場PCV2 的感染率高達(dá)67.8%，并選取具有代表性的74 株P(guān)CV2 進(jìn)行全基因組測序，其中56 株P(guān)CV2b 基因型。同一時期，Wei 等自我國南方14 個商業(yè)化豬場分離到66 株P(guān)CV2 ，其中92.42% 的毒株屬于PCV2b 基因型。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國優(yōu)勢流行基因型為PCV2b 。,,目前，國外有很多關(guān)于PCV2 流行毒株的變異的報道，但是

15、我國對此研究比較少。2011 年Cai 分離到了5 株P(guān)CV2a 和PCV2b 基因型間重組毒，重組位點均位于ORF2 區(qū)段內(nèi)。Guo 對2004-2008 年采集自我國10 個省份疑似PCV2 感染的病料中分離到19 株P(guān)CV2 ，有4 株病毒ORF2 編碼基因發(fā)生突變，同時選取了2 株突變株進(jìn)行致病性實驗，發(fā)現(xiàn)突變株所造成的病理損傷、病毒血癥、淋巴組織等免疫器官損傷明顯嚴(yán)重，新出現(xiàn)的突變株如何增強(qiáng)毒力的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。,,P

16、CV2在我國豬群中已經(jīng)廣泛存在，主要有PCV2a 和PCV2b 兩種基因型，自2005 以來主要以PCV2b 基因型流行為主，同時出現(xiàn)mPCV2b 毒株，未發(fā)現(xiàn)PCV2c 基因型。,,國外上市疫苗有滅活疫苗、Cap亞單位疫苗和PCV1-2 嵌合病毒滅活疫苗,均基于PCV2a 基因型，雖然PCV2a 疫苗能降低豬臨床PCVAD ,減少PCV2a 的流行,但是不會顯著減少PCV2b 在豬群中的傳播。日本研究者發(fā)現(xiàn),PCV2 疫苗的免疫效果與

17、PCV2 基因型有很大關(guān)系,流行毒株與疫苗株遺傳關(guān)系越近，疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)效力越好。為了進(jìn)一步證實這一發(fā)現(xiàn)，Tanja Opriessniga 用PCV2a 型疫苗和PCV2b 型疫苗分別免疫豬群，PCV2進(jìn)行攻毒，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2b 型疫苗可以抵抗PCV2b、PCV2a/PCV2b 共感染提供更好的免疫保護(hù)。,,國內(nèi)上市疫苗屬于PCV2b 型滅活疫苗，雖然與流行毒株屬于同一基因型，但是傳統(tǒng)滅活疫苗抗原制備上病毒滴度低，生產(chǎn)周期

18、長，且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要為體液免疫，忽視了細(xì)胞免疫應(yīng)答在PCV2 免疫保護(hù)中的作用。雖然商品化疫苗的應(yīng)用為有效防控PCV2 感染發(fā)揮了重要作用，但是疫苗株與流行株分屬不同基因型，且傳統(tǒng)疫苗在免疫保護(hù)效力和生產(chǎn)制備上存在缺陷。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基于PCV2b 型的活載體疫苗、核酸疫苗及標(biāo)記疫苗等新型疫苗也展現(xiàn)出良好的研究前景。,PCV2滅活疫苗,PCV2 滅活疫苗是將PCV2 感染的細(xì)胞培養(yǎng)物通過理化方法處理，使其喪失感染性但仍保持

19、良好的免疫原性，然后加入佐劑乳化制備而成。該類疫苗具有使用安全，易于保存，性能穩(wěn)定等優(yōu)點。,,,,,,,,國外學(xué)者較早投入PCV2 滅活疫苗的研究工作中，法國梅里亞公司于2006年成功研制出通過歐盟認(rèn)證的首例PCV2 全病毒滅活疫苗Circovac®。Opriessnig 等研究發(fā)現(xiàn)，用Circovac®免疫妊娠母豬和仔豬均能降低仔豬PCV2 病毒血癥和各組織器官中病毒載量，促進(jìn)新生仔豬的生長，其原因可能是由于在給妊

20、娠母豬注射疫苗后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗PCV2 的特異性抗體，仔豬通過吮吸初乳獲得了抵抗PCV2 感染的被動免疫力。,,Kurmann用該疫苗免疫PCV2 亞臨床感染的母豬，共分３次免疫，首免和二免分別在妊娠前４周和２周進(jìn)行，三免在妊娠期第12 周進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫母豬的血清抗體水平比未免疫母豬的血清抗體水平提高了３～９倍，新生仔豬的血清抗體水平也隨之增加，并能提高仔豬平均日增重率，縮短仔豬育肥期。由此可見，Circovac®具備

21、優(yōu)良的免疫效果，能使免疫母豬和免疫仔豬獲得穩(wěn)定的群體免疫力，保護(hù)其免受PCV2 感染。,,在國內(nèi)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長明研究員成功地研制出中國首例PCV2 滅活疫苗(LG株)，該疫苗具有抗原含量高、免疫原性強(qiáng)、安全性好、抗母源抗體干擾及免疫效果好等特點，臨床試驗結(jié)果表明，疫苗接種豬群與空白對照組對比，主動免疫仔豬發(fā)病率下降15.1%，死淘率下降3.6%；被動免疫母豬結(jié)果顯示，出生時死胎率下降2.3%，初生仔豬成活率提高7.

22、6%，斷奶時成活率提高7.5%。該疫苗的使用對我國PCV2 流行有效地進(jìn)行防控，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。此外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授研制的PCV2 滅活疫苗（SH株）也已注冊上市，目前正在全國大部分地區(qū)推廣使用，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。這２種疫苗的成功研制和應(yīng)用對防控我國PCV2 感染發(fā)揮了重大作用。,,,,,,,,,PCV2弱毒疫苗,弱毒疫苗又稱為減毒活疫苗，是將病原體的致病力通過自然篩選或人工致弱等方式減弱制備而成。盡管該類疫苗的毒

23、力已經(jīng)致弱，但仍然保持著原有的免疫原性，并能在動物體內(nèi)繁殖，刺激動物機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生堅實的免疫力和持久的保護(hù)力。,,國內(nèi)外對PCV2 弱毒疫苗研究的報道較少，目前還沒有商品化的PCV2 弱毒疫苗，主要原因與病毒毒力易返強(qiáng)、致弱毒株毒力評價困難等因素有關(guān)。Fenaux等將PCV2 分離株在PK15 細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第120 代病毒(VP120)滴度約為第１代病毒(VP1)滴度的10 倍，VP120 感染的仔豬出現(xiàn)病毒

24、血癥的發(fā)生率明顯低于VP1 感染的仔豬，并且感染仔豬的血清中PCV2 DNA拷貝數(shù)更低，眼觀和病理組織學(xué)變化也更輕，表明體外傳代可促進(jìn)PCV2 在細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力，并能減弱其致病力，這為研制PCV2 弱毒疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。由于單一PCV2 感染對豬的致病性并不十分典型，病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，其毒力是否返強(qiáng)等關(guān)鍵問題沒有闡明，試驗數(shù)據(jù)有限，這種方法得到的毒力減弱毒株作為疫苗離應(yīng)用還有很長的路要走。,PCV2亞單位疫苗,Cap 蛋白是PCV

25、2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原，能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生針對PCV2 的特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2 基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2 亞單位疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要是昆蟲細(xì)胞／桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。國外已有3種PCV2 亞單位疫苗注冊上市，分別是勃林格公司研制的Ingelvac CircoFLEX®，英特威公司研制的Circumvent® 以及先靈葆雅公司研制的Porcilis® PCV ，這3種

26、疫苗均為桿狀病毒表達(dá)的Cap 蛋白亞單位疫苗。,,Opriessnig 等比較了單劑量的Ingelvac CircoFLEX® 和兩劑量的Circumvent®對３周齡以上仔豬的免疫保護(hù)效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用PCV2 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬流感病毒(SIV)感染免疫仔豬后，無論以單劑量還是兩劑量疫苗免疫，均能明顯降低病毒血癥的發(fā)生率，減輕PCV2 、PRRSV 及SIV 混合感染對淋巴組織的損傷。,,

27、Fort等研究了單劑量Porcilis® PCV 對不同地區(qū)、不同基因型PCV2 感染的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗對來自不同地區(qū)、不同基因型的PCV2 感染具有良好的免疫保護(hù)力，既能誘導(dǎo)免疫仔豬產(chǎn)生針對PCV2 的特異性體液免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，能顯著減輕病毒血癥，減少鼻腔和排泄物中PCV2 的排出量，降低各組織器官中PCV2 的病毒載量。,,,,青島易邦生物工程有限公司常務(wù)副總經(jīng)理范根成博士介紹了易邦“易圓凈

28、”擁有的幾個突出特點：1）率先建立豬圓環(huán)疫苗評價體系，引領(lǐng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；2）表達(dá)病毒樣顆?？乖╒LPS/CAP），抗原性好，能高效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好體液免疫與細(xì)胞免疫，免疫后15-20天100%轉(zhuǎn)陽，持續(xù)時間可達(dá)5個月；3）水性佐劑+免疫增強(qiáng)劑，注射方便，無副反應(yīng)；4）100多萬頭豬臨場使用表明“易圓凈”安全、高效、無副作用，免疫豬各項生產(chǎn)性能良好。只需一針，保護(hù)至出欄；5）2-4周齡豬免疫，每頭2ml；管理良好豬場每頭1-1.5

29、ml；在未免疫或免疫失敗豬群，在發(fā)病早期可以緊急接種，每頭2ml。,,腺病毒活載體疫苗,腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體具有諸多優(yōu)勢：宿主范圍廣，插入外源基因能力強(qiáng)，能在許多哺乳動物細(xì)胞和組織中表達(dá)重組蛋白，表達(dá)外源基因效率高，能對表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行精細(xì)的修飾。基于以上優(yōu)勢，腺病毒載體現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因工程疫苗研發(fā)，基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域。,,Wang 等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2 ORF2 基因的重組腺病毒rAD-Cap，然后通過動物免疫保護(hù)試

30、驗評價rAD-Cap 對仔豬的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在首免后３７ｄ即能檢測到抗PCV2 的高水平ELISA 抗體和病毒中和抗體，免疫仔豬的相對日增體質(zhì)量率顯著高于攻毒對照組，而組織損傷程度和病毒血癥的發(fā)生率卻明顯低于攻毒對照組。,,Liu等成功構(gòu)建了融合表達(dá)PCV2 ORF2 基因與豬IFN-γ基因的重組腺病毒PCV2 ORF2-IFN-γ，并證實PCV2 ORF2 -IFN-γ在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2 特異性抗體的能力比單獨表達(dá)C

31、ap蛋白的PCV2 ORF2 強(qiáng)，表明豬IFN-γ作為細(xì)胞因子佐劑可以顯著增強(qiáng)Cap蛋白的免疫原性。,,由此可見，表達(dá)Cap 蛋白的重組腺病毒能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生針對PCV2的特異性免疫應(yīng)答，保護(hù)動物抵抗PCV2 感染，是一種具有潛在應(yīng)用價值的PCV2 候選疫苗。然而，腺病毒作為表達(dá)載體也存在些許不足，如腺病毒載體由于不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA 中，因此不能形成外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；腺病毒的靶向性差；腺病毒顆?？杀桓闻K的Kupffer

32、細(xì)胞非特異性吸收，表現(xiàn)出很強(qiáng)的首過效應(yīng)等。因此，只有對腺病毒載體不斷進(jìn)行改進(jìn)和完善，才能充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價值。,偽狂犬病毒活載體疫苗,偽狂犬病毒基因組是線狀雙鏈DNA 分子，大小約150ｋｂ，含有許多病毒非必需基因，可以插入和表達(dá)多種病原體的免疫保護(hù)性抗原基因。偽狂犬病毒較穩(wěn)定，免疫原性持久；缺失毒力基因的偽狂犬病毒安全性好，能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此，該病毒已逐漸發(fā)展成為哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的高效表達(dá)載體之一

33、，廣泛應(yīng)用于基因工程藥物和基因工程疫苗的開發(fā)與研制等領(lǐng)域。,,Ju 等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2 ORF1-ORF2 融合蛋白的重組偽狂犬病毒PRV-PCV2 ，Western blot 試驗證實ORF1-ORF2 融合蛋白在重組病毒中正確表達(dá)，用PRV-PCV2 免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PRV-PCV2 的特異性抗體，保護(hù)小鼠抵抗PRV Ea 強(qiáng)毒株攻擊；而且，仔豬免疫試驗也證實PRV-PCV2 能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對PRV和PCV

34、2 的特異性免疫應(yīng)答。,,Song 等將PCV2 ORF2 基因插入ｐIECMV 質(zhì)粒中，并同偽狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，通過同源重組成功構(gòu)建了Tk-/gE-/ORF2重組病毒，Western blot和間接免疫熒光試驗證實PCV2 ORF2基因在重組病毒中正確表達(dá)。４周齡仔豬接種Tk-/gE-/ORF2后，PRV-ELISA、PRV－中和試驗、ORF2-ELISA和ORF2特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗證

35、實重組病毒具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生針對PRV和PCV2 的特異性免疫應(yīng)答。由此可見，重組偽狂犬病病毒能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生針對PRV和PCV2 的特異性免疫應(yīng)答，保護(hù)動物抵抗PRV和PCV2 感染，與重組腺病毒對比，該重組偽狂犬病毒能在豬體內(nèi)很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2 二聯(lián)活載體疫苗研制方面具有巨大的潛力和應(yīng)用價值。,假型桿狀病毒載體疫苗,Ｆan等將水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFast Bac１

36、多角體蛋白基因啟動子下游，并在VSV-G 表達(dá)元件下游引入巨細(xì)胞病毒早期（CMV-1E）啟動子和BGH poly(A)　,成功構(gòu)建了一種類似桿狀病毒的假型桿狀病毒BV-G-CMV ，但其能感染哺乳動物細(xì)胞，并能在病毒粒子囊膜展示VSV-G。,,隨后，F(xiàn)an等將PCV2 ORF2 基因定向插入BV-G-CMV CMV-1E　啟動子下游，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后獲得了重組假型桿狀病毒BV-G-ORF2 ，Western blot與流式細(xì)胞術(shù)檢測

37、結(jié)果顯示BV-G-ORF2 能在PK15細(xì)胞中高效表達(dá)Cap蛋白。,,以1×108 或1×109 PFU 劑量的BV-G-ORF2 免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PCV2 特異性ELISA 抗體、中和抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且即使以1×108 PFU 劑量免疫，BV-G-ORF2也展現(xiàn)出比PCV2 DNA 疫苗更強(qiáng)的免疫原性。BV-G-CMV作為基因轉(zhuǎn)移載體具有操作簡單、病毒易培養(yǎng)、無毒性、免疫原性強(qiáng)及宿

38、主體內(nèi)不存在抗桿狀病毒的抗體等優(yōu)點，因此，假型桿狀病毒可用于新型PCV2 活載體疫苗的研究。,豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體疫苗,Pei 等在PRRSV cDNA克隆的ORFs 1b與2a 之間插入２個限制性酶切位點和１個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6，將其改造成一個通用的病毒載體，然后將PCV2 ORF2 基因插入２個限制性酶切位點之間，由TRS6啟動轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了表達(dá)Cap 蛋白的重組質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞成功獲得了P129-P

39、CV 重組PRRSV。,,動物免疫試驗證實：免疫５周后，在P129-PCV 免疫的豬體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2 特異性抗體應(yīng)答，表明重組PRRSV 能在體內(nèi)和體外成功表達(dá)Cap 蛋白，并誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，可作為一種表達(dá)載體用于PCV2 及其他豬病活載體疫苗的研究。然而，該重組PRRSV 體外傳代是否穩(wěn)定、目的基因經(jīng)傳代是否會丟失等問題有待進(jìn)一步的試驗數(shù)據(jù)加以證實。,噬菌體載體疫苗,研究表明，噬菌體表面展示技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于疫苗的開發(fā)與研究。

40、將病原體的保護(hù)性抗原與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌體的表面，以此來構(gòu)建表達(dá)外源抗原的重組噬菌體顆粒，即噬菌體載體疫苗。噬菌體載體疫苗因安全，穩(wěn)定，不需要佐劑及易于規(guī)模化生產(chǎn)等特點而日益受到研究人員的重視。,,Gamage 等將PCV2 Cap 蛋白的優(yōu)勢表位區(qū)克隆至λ噬菌體展示顆粒(LDP)頭部蛋白(D)基因下游形成融合基因，成功構(gòu)建了表達(dá)融合蛋白D-CAP 的重組λ噬菌體展示載體LDP-D-CAP，ELISA和Wester

41、n blot 檢測結(jié)果顯示D-CAP 在LDP 的表面正確表達(dá)，用LDP-D-CAP 免疫仔豬后，沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，首免后即可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2 的特異性免疫反應(yīng)，不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2 中和抗體，而且能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明PCV2 噬菌體載體疫苗有望作為一種新型的活載體疫苗用于防控PCV2 感染。,乳酸菌口服活載體疫苗,乳酸菌在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，是一類安全的口服細(xì)菌，可以作為活疫苗載體表達(dá)外源抗原，因而日益受到研究者

42、的重視。Wang 等將缺失核定位信號區(qū)的PCV2 ORF2 基因克隆入大腸桿菌／乳酸鏈球菌穿梭載體pSEC:LEISS，構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap, 電轉(zhuǎn)化乳酸菌后獲得了重組乳酸菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap, Western blot試驗證實Cap 蛋白在乳酸鏈球菌中正確表達(dá)，在給小鼠口服重組乳酸鏈球菌培養(yǎng)物后可檢測到高水平的PCV2 特異性抗體，表明乳酸鏈球菌作為抗原轉(zhuǎn)移載體可用于PCV2 口服

43、活疫苗的研發(fā)，具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。,博德特氏菌載體疫苗,研究證實，支氣管炎博德特氏菌具有很強(qiáng)的感染性，這使得其很容易定植于呼吸道黏膜，因此，應(yīng)用致弱的支氣管炎博德特氏菌作為活載體將異種抗原遞呈至哺乳動物乃至人的呼吸道是可以實現(xiàn)的。Kim 等將PCV2 ORF2 基因定向克隆入aroA 突變的支氣管炎博德特氏菌，電轉(zhuǎn)化后獲得了表達(dá)Cap 蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP) ，然后用活BBS-MCP 免疫小鼠和豬，ELISA 檢測結(jié)

44、果顯示在血清中存在高水平的抗Cap 蛋白特異性IgG 抗體，用PCV2 感染后，在活BBS-MCP 免疫的豬淋巴結(jié)中檢測不到PCV2 DNA，結(jié)果表明BBS-MCP 免疫能有效保護(hù)豬群抵抗PCV2 感染，這一發(fā)現(xiàn)為PCV2 減毒活疫苗的研發(fā)提供了新的思路。,,此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，因其操作簡單、細(xì)胞生長快速、能大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，而且能對重組蛋白進(jìn)行相對正確的折疊和翻譯后加工修飾等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的商品化疫苗研

45、發(fā)。Bucarey 等將PCV2 Cap 蛋白基因密碼子優(yōu)化后克隆入大腸桿菌／釀酒酵母穿梭載體(pYES2)，然后轉(zhuǎn)化宿主菌INVSc1，Western blot 試驗證實Cap 蛋白在酵母細(xì)胞中正確表達(dá)，電鏡下觀察到Cap 蛋白表達(dá)后可以自我組裝形成類似PCV2 的病毒樣顆粒，給小鼠口服含Cap 蛋白的酵母提取物后，在血清中可檢測到抗Cap 蛋白的特異性抗體，表明釀酒酵母作為一種非常有吸引力的表達(dá)載體可用于PCV2 口服活疫苗的研制。

46、,PCV2核酸疫苗,核酸疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫應(yīng)答持久，制備簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)，安全性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，現(xiàn)已成為疫苗學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。研究證實，含PCV2 ORF2 基因的質(zhì)粒載體（ｐORF2 ）能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)PCV2 特異性抗體陽轉(zhuǎn)，能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生抗PCV2 感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，而且ｐORF2免疫的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2 中和抗體的能力比單獨用Cap 蛋白免疫的小鼠強(qiáng)，攻毒后免疫組小鼠臨床癥

47、狀和病理變化明顯減輕，PCV2 病毒載量也顯著下降。,,Fenaux 等用PCV1-2 嵌合病毒DNA 疫苗免疫仔豬，免疫后42d ，檢測到大部分仔豬PCV2 抗體陽轉(zhuǎn)，攻毒后21d ，對照組仔豬出現(xiàn)病毒血癥，淋巴結(jié)腫大，淋巴組織衰竭等癥狀，而免疫組仔豬未出現(xiàn)病毒血癥，淋巴組織損傷程度較輕，淋巴組織的病毒載量顯著降低，表明PCV1-2 嵌合病毒DNA 疫苗可以有效預(yù)防PCV2 感染。,,Ａｒａｖｉｎｄａｒａｍ 等分別構(gòu)建了含PCV2 O

48、RF-1、ORF-2、ORF-3 的重組質(zhì)粒p3224-ORF-1、-2和-3，3種重組質(zhì)粒單獨或聯(lián)合免疫小鼠２周后，用相應(yīng)的MVA-ORF-1、-2和-3以單獨或聯(lián)合形式加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF-2/-3 與ORF-1/-2/-3這２種組合免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF 以及PCV2 抗體水平均較其它免疫組高，攻毒后這２種組合免疫組PCV2 病毒載量顯著減少，小鼠的肺部病變也明顯減輕。盡管核酸疫苗具有諸多優(yōu)點，但外

49、源基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控及其在體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移可能會產(chǎn)生意外的免疫病理反應(yīng)等瓶頸問題使得目前絕大部分核酸疫苗的研究還僅局限于實驗室。,PCV1-2嵌合疫苗,嵌合疫苗是應(yīng)用基因工程手段來構(gòu)建的一類新型疫苗，美國富道公司已經(jīng)研發(fā)出商品化的PCV1-2 嵌合疫苗Suvaxyn® PCV2 One DoseTM，其原理是用PCV2 ORF2 基因置換無致病性的PCV1 ORF2 基因，構(gòu)建PCV1-2 嵌合病毒，然后將其滅活制備而成，該類

50、疫苗現(xiàn)已在美國、加拿大、墨西哥、丹麥、菲律賓及新西蘭等國申請注冊。2011 年，美國輝瑞公司與富道公司合并后，將Suvaxyn® PCV2 One DoseTM更名為FosteraTM PCV。,,Ｓｅｇａｌéｓ等對Suvaxyn-PCV2 的免疫保護(hù)效力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫豬群的臨床癥狀大大減輕，淋巴組織和血液中PCV2的病毒載量、保育豬和育肥豬的死亡率以及PMWS 的發(fā)生率均顯著降低，表明Suvaxyn-PC

51、V2 能有效誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生PCV2 中和抗體，保護(hù)豬群抵抗PCV2 感染，并降低PMWS 的發(fā)生率，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。,,眾所周知，如果仔豬體內(nèi)存在母源抗體，將會干擾疫苗的免疫效能，為驗證母源抗體的存在對Suvaxyn® PCV2 One DoseTM 免疫效能的影響，Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ等選擇有母源抗體存在的仔豬作為實驗動物，在Suvaxyn® PCV2 One DoseTM 免疫后28d 進(jìn)行PCV2

52、 感染試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組對比，免疫組仔豬血清中PCV2 病毒載量顯著降低，淋巴組織損傷程度也明顯減輕，表明即使存在母源抗體，Suvaxyn® PCV2 One DoseTM 仍能顯著提高仔豬對PCV2 感染的免疫力。,,PCV2標(biāo)記疫苗,PCV2 標(biāo)記疫苗是指應(yīng)用DNA 重組技術(shù)將分子標(biāo)記插入PCV2 基因組中而研制的一類新型的重組疫苗，該類疫苗毒株可與野毒株相區(qū)別。,,Beach 等將GLU 或KT3 標(biāo)簽定向克隆至P

53、CV1-2 嵌合病毒Cap 蛋白的Ｃ末端，成功構(gòu)建了２種帶分子標(biāo)記的PCV1-2 嵌合病毒，并證實其能在PK15 細(xì)胞上增殖，試驗感染豬后能在血清中檢測到PCV2 中和抗體和抗GLU 或KT3 標(biāo)簽的特異性抗體。Huang 等將V5 標(biāo)簽插入PCV2 Cap蛋白的Ｃ末端，成功構(gòu)建了表達(dá)V5 標(biāo)簽的PCV2 重組病毒，并證實重組病毒和親本毒株具有相似的生物學(xué)特征，用重組病毒免疫小鼠后能誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2 中和抗體和抗V5 標(biāo)簽的特異性抗體。

54、,,這些研究結(jié)果表明：帶GLU 或KT3 標(biāo)簽的PCV1-2 嵌合病毒或帶V5 標(biāo)簽的PCV2 重組病毒有望作為研制PCV2 標(biāo)記疫苗的候選疫苗株，為臨床區(qū)分PCV2 自然感染和疫苗免疫奠定了堅實的基礎(chǔ)。,存在問題及展望,豬圓環(huán)病毒疫苗市場充滿機(jī)遇和挑戰(zhàn)。根據(jù)2012 年中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒顯示，2011 年末，我國生豬出欄量約6.6 億頭，存欄量4.6 億頭。作為我國強(qiáng)制性免疫的豬瘟和豬藍(lán)耳病，其每種疫苗的需求量都在15-20 億頭份/年

55、。以我國生豬存欄量,豬瘟疫苗和豬藍(lán)耳疫苗的需求量為參照，豬圓環(huán)病毒疫苗市場需求遠(yuǎn)未飽和，優(yōu)質(zhì)的豬圓環(huán)病毒疫苗將能為企業(yè)帶來新的經(jīng)濟(jì)增長點和競爭力，各生產(chǎn)廠家具有很大的市場空間。同時隨著國際獸用生物制品企業(yè)進(jìn)軍中國建廠和尋求合作，獸用生物制品行業(yè)將面臨更加激烈的競爭，也要求國內(nèi)企業(yè)迎接競爭，盡快改進(jìn)生產(chǎn)工藝，加快研發(fā)，提高圓環(huán)疫苗的質(zhì)量。,,諸多PCV2 疫苗效能試驗已證實目前商品化的PCV2 疫苗在一定程度上可以有效防控PCV2 感染，

56、能顯著降低PCV2 感染豬群的臨床癥狀，提高豬的生長性能，然而疫苗免疫并不能完全阻斷PCV2 傳播，亦不能完全清除體內(nèi)已感染的病毒。此外，就目前商品化的PCV2 疫苗而言，無論是國外進(jìn)口的還是國產(chǎn)疫苗，市場價格普遍較高，這在一定程度上給養(yǎng)殖戶造成了經(jīng)濟(jì)壓力，因此，研制高效、低廉的新型疫苗是今后的必然趨勢。,,總之，PCV2 疫苗研究總體呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢，在國內(nèi)外研究人員的不懈努力下，相繼研制出PCV2 全病毒滅活疫苗、pcv1-2

57、嵌合病毒疫苗及基于Cap 蛋白的PCV2 亞單位疫苗。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，活載體疫苗、核酸疫苗及標(biāo)記疫苗等PCV2 新型基因工程疫苗正在研究中，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。針對當(dāng)前PCV2 商品化疫苗生產(chǎn)成本較高、病毒難培養(yǎng)的現(xiàn)實，開發(fā)高效、低廉的PCV2 新型活載體疫苗、核酸疫苗等基因工程疫苗是今后研究的趨勢。,,目前國內(nèi)外已商品化的圓環(huán)疫苗均是單苗，聯(lián)合圓環(huán)疫苗開發(fā)將是未來研發(fā)方向之一，采用新技術(shù)、新材料將與一種或多種