豬2型圓環(huán)病毒核酸疫苗及重組偽狂犬病毒二價(jià)基因工程疫苗的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)不僅可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，而且也與豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬先天性震擅、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎等疾病密切相關(guān)。自從19世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)可致豬的疾病以來(lái)，PCV2病毒在世界各國(guó)迅速蔓延。目前PCV2在豬群的感染率非常高，造成豬的生長(zhǎng)緩慢，飼料報(bào)酬下降，同時(shí)侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬的免疫機(jī)能下降，造成其它疾病的大暴發(fā)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的

2、經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)也于2000年檢測(cè)到了該病毒的存在，該病毒在我國(guó)豬群的感染率近乎50％，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)也造成了嚴(yán)重的打擊。目前對(duì)于該病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于該病毒在細(xì)胞上增殖滴度很低，發(fā)展傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗非常困難，因此用現(xiàn)代基因工程手段構(gòu)建的第二代新型疫苗，必然在該病毒的防制上具有重要作用。本研究以編碼PCV2核衣殼蛋白的ORF2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，實(shí)現(xiàn)了ORF2基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步將ORF2基因插入核酸疫苗載體構(gòu)

3、建了ORF2基因的核酸疫苗和“自殺性”DNA疫苗；同時(shí)將具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的BVP22基因與ORF2基因在核酸疫苗和“自殺性”DNA疫苗中融合表達(dá)，通過(guò)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)疫苗的免疫效應(yīng)；以偽狂犬病毒弱毒株 TK<'->/gE<'->/LacZ<'+>為親本毒，構(gòu)建了表達(dá)ORF2基因的重組偽狂犬病毒 TK<'->/gE<'->/ORF2<'+>；同時(shí)對(duì)構(gòu)建的PCV2疫苗進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，以探索一種可用于PCV2防制的新型疫苗。 1．PCV2

4、 ORF2及BHV-1 VP22基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)及定位研究通過(guò)PCR方法擴(kuò)增PCV2 ORF2基因和BHV-1 VP22基因，將擴(kuò)增的基因連入T載體克隆測(cè)序后，用Hind Ⅲ和BglⅡ雙酶切將ORF2基因切下，連入pEGFP-N1載體的HindⅢ和BamH Ⅰ雙酶切位點(diǎn)，得到ORF2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pNORF2。用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ?qū)VP22基因從T載體上切下，連入pEGFP-N1載體的 BamH Ⅰ位點(diǎn)，得到 BVP2

5、2 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 pNBVP22。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pEGFP-N1、pNORF2和pNBVP22質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染18 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染pNORF2的Hela細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，且明顯分布于核周，轉(zhuǎn)染pNBVP22的細(xì)胞也有熒光表達(dá)，熒光主要分布于核周，而在細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)有大量的熒光，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細(xì)胞則在整個(gè)細(xì)胞都可見(jiàn)散在熒光。以上結(jié)果說(shuō)明了克隆的ORF2基因、BVP22基

6、因在真核細(xì)胞中成功表達(dá)，為基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。 2．PCV2核酸疫苗的構(gòu)建、免疫效應(yīng)研究，以及BVP22基因免疫增強(qiáng)效應(yīng)研究PCR擴(kuò)增 PCV2 ORF2 和 BVP22 基因，將 ORF2 基因克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，構(gòu)建了PCV2的核酸疫苗pCORF2，同時(shí)分別將具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的BVP22基因分別克隆到 ORF2 基因的上游和下游，使二者融合表達(dá)，構(gòu)建pCORF2BVP22、pCBVP22ORF

7、2質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒以及空載體pCDNA3.1肌肉免疫BALB/c小白鼠，共免疫2次，間隔2周，分別于首免后2周和二免后4周采血，用ELISA法檢測(cè)體液抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)兩次免疫后，加入蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸疫苗組產(chǎn)生了PCV2特異性抗體，而單獨(dú)用ORF2基因構(gòu)建的核酸疫苗的免疫原性比較弱，證明BVP22可增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，可作為PCV2防制的一種候選疫苗。 3．PCV2“自殺性”DNA

8、疫苗的構(gòu)建、免疫效應(yīng)研究，以及BVP22在“自殺性”DNA疫苗中的免疫增強(qiáng)效應(yīng)研究將PCV2 ORF2基因克隆到“自殺性”DNA疫苗載體pSCA1和pSHAME2a，構(gòu)建了ORF2的“自殺性”DNA疫苗pSORF2和pMORF2。進(jìn)一步將BVP22基因插入ORF2基因的上游，構(gòu)建了pSBVP22ORF2、pMBVP22ORF2“自殺性”DNA疫苗載體。肌肉注射免疫 BALB/c 小白鼠，首免后2周加強(qiáng)免疫一次，分別于首免后2周和6周采血

9、，用 ELISA 方法檢測(cè)血清體液抗體水平。從ELISA檢測(cè)結(jié)果可以看出，一次免疫后2周即可刺激小白鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性體液抗體，而B(niǎo)VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的效果在“自殺性”DNA疫苗中的效果并不明顯。 4．表達(dá)PCV2 ORF2基因的重組偽狂犬疫苗毒株的構(gòu)建將ORF2基因插入偽狂犬病毒重組轉(zhuǎn)移載體pIECMV，構(gòu)建ORF2基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIEORF2。用EcoR Ⅰ酶切偽狂犬病毒疫苗株Tk<'->/gE<'->/LacZ<

10、'+>基因組，與重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIEORF2共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞。收集病變細(xì)胞，經(jīng)空斑純化和PCR篩選，獲得了新的重組病毒Tk<'->/gE<'->/ORF2<'+>。Southern blotting雜交結(jié)果顯示，ORF2基因插入了PRV基因組預(yù)期的位置，用間接免疫熒光法和Western blotting雜交方法證明了插入的基因可在該重組病毒中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)該病毒在IBRS-2細(xì)胞上連續(xù)傳代15代后遺傳穩(wěn)定。該重組病毒在各種細(xì)胞上增殖

11、滴度高，在IBRS-2細(xì)胞上增殖滴度為10<'-7.1>TCID<,50>/0.1mL，在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖滴度為10<'-4.8>TCID<,50>/0.1mL，在Marc-145細(xì)胞上增殖滴度為10<'-6.8>TCID<,50>/0.1mL。 5．PCV2-PRV 重組二價(jià)基因工程疫苗的免疫效應(yīng)研究用上述構(gòu)建的偽狂犬重組病毒疫苗株Tk<'->/gE<'->/ORF2<'+>免疫28日齡左右斷奶仔豬5頭，作為對(duì)照同時(shí)用偽狂

12、犬基因缺失病毒疫苗株Tk<'-1>/gE<'->/gI<'->免疫28日齡斷奶仔豬5頭，空白對(duì)照3頭注射2 mL DMEM。首免后3周加強(qiáng)免疫一次，在首免后0，21，35，49天采血，用ELISA和中和試驗(yàn)的方法檢測(cè)血清中的PRV和PCV2抗體，在第49天檢測(cè)PCV2特異的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，用Tk<'->/gE<'->/ORF2<'+>、Tk<'->/gE<'->/gI<'->免疫豬在免疫后21天即可檢測(cè)到抗偽狂犬病毒的中