豬偽狂犬病病毒gE基因核酸探針的制備及應(yīng)用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又稱Aujeszky氏病，是由偽狂犬病病毒引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬一般除外）、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的重要傳染病。在根除偽狂犬病的過程中，疫苗扮演了重要的角色。在各種疫苗中基因缺失疫苗是應(yīng)用最廣泛的，目前商業(yè)化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，甚至立法規(guī)定只允許gE(gI)基因缺失疫苗使用。本試驗(yàn)根據(jù)我國(guó)目前廣泛使用的偽狂犬疫苗大多缺失gE基因這一特性，克

2、隆了PRV-S株gE基因的部分序列，分析了序列的結(jié)構(gòu)、同源性，對(duì)PRV-S株gE基因的部分序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并用地高辛將擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記制成核酸探針，用制備的核酸探針進(jìn)行了臨床病料的檢測(cè)。通過一系列試驗(yàn)，本試驗(yàn)取得如下的成果:
　　 1.根據(jù)GenBank收錄的PRV-Min-A株(登錄號(hào)為AY170318)、PRV-LA株(登錄號(hào)為AY173124)、PRV-Ea株（登錄號(hào)為AF171937）、Korea株（登錄號(hào)為AY249

3、861）及AF207700株的gE基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，運(yùn)用PCR方法從PRV-S株基因組中克隆了304bp的gE基因DNA部分序列。該序列與以上五株不同地域的野毒gE基因序列經(jīng)DNAStar軟件比較后發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的同源性均在98％以上，說明該片段可用于制備核酸探針來檢測(cè)豬偽狂犬病野毒感染。
　　 2.以含有g(shù)E基因部分序列的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)地高辛標(biāo)記后制成gE基因核酸探針。特異性檢測(cè)該探針只與P

4、RV-S株DNA有陽(yáng)性反應(yīng)，而與PRVBartha-k61株疫苗毒DNA、PPVDNA、PCVDNA、PRRSVcDNA、CSFVcDNA反應(yīng)均為陰性，說明該核酸探針具有良好的特異性。敏感性檢測(cè)說明該探針至少可檢測(cè)到4pg的DNA片段，具有較好的敏感性。
　　 3.用制備的gE基因核酸探針對(duì)臨床采集的32份豬繁殖障礙病料進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，結(jié)果4份病料呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。而同時(shí)用針對(duì)gE基因設(shè)計(jì)的引物對(duì)32份病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，也檢出