豬偽狂犬病病毒河南株的分離鑒定、gE基因克隆與序列分析及原核表達.pdf

1、參照genbank中公布的minA株P(guān)RV gE基因序列(序列號：AY170318)設(shè)計了一對特異性引物，通過一系列條件優(yōu)化建立了PRY的PCR診斷方法。2007年作者從河南省部分發(fā)病豬場采集臨床癥狀明顯的、疑似PR的病死仔豬內(nèi)臟和腦組織，利用所建立的PCR方法進行檢測，將PRV陽性并且無圓環(huán)病毒混合感染的病料接種PK-15細胞，連續(xù)傳代后均出現(xiàn)與陽性對照一致的典型病變，并且利用PCR方法對細胞培養(yǎng)物進行了鑒定。結(jié)果表明，成功分離到4株

2、PRV，且無圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒污染，將分離株分別命名為HNJZ株(焦作株)、HNDF株(登封株)、HNTY株(湯陰株)、HNNY株(南陽株)。 參照genbank中公布的minA株P(guān)RVgE基因序列(序列號：AY170318)設(shè)計了兩對特異性引物，分別用于gE全基因和主要抗原表位基因的擴增，并通過條件優(yōu)化建立了相應(yīng)的PCR擴增方法。利用該方法從分離到的HNJZ株中擴增出了gE全基因片段，而從分離到的4株P(guān)RY中均擴

3、增出gE主要抗原表位基因片段。將所擴增到的基因片段克隆到PGM-T載體中，通過篩選與鑒定獲得了相應(yīng)的陽性重組質(zhì)粒，并測序獲得了插入片段的基因序列，進行了相應(yīng)分析。HNJZ株與國內(nèi)外其他毒株的gE基因序列比對結(jié)果顯示：不同地域分離株核苷酸同源率達97.3％-99.9％，推導(dǎo)氨基酸序列同源率達94.8％-99.8％，這說明gE基因比較保守；HNJZ株與國內(nèi)的minA株及韓國的yangshan株同源率最高，而且結(jié)合遺傳進化分析可知HNJZ株與

4、國內(nèi)minA株和國外的yangshan株親緣關(guān)系較近；HNJZ株gE基因所編碼的氨基酸序列中發(fā)生了4處變異，但均不在其主要抗原表位區(qū)內(nèi)。4株河南PRV分離株的gE基因主要抗原表位區(qū)的核苷酸同源率和氨基酸同源率均在96％以上，因為4株P(guān)RV的分離地在河南省內(nèi)的跨度較大，所以可以初步推測河南省內(nèi)不同地方PRY變異很小。而且高度的同源性也進一步說明gE基因主要抗原表位區(qū)很保守，這為gE基因主要抗原表位區(qū)的表達及相應(yīng)診斷方法的建立提供了科學(xué)的理

5、論依據(jù)。 在以上的研究基礎(chǔ)之上，根據(jù)HNJZ株的gE基因序列，設(shè)計了一對引物用于擴增編碼gE主要抗原表位的基因片段，并將其克隆到表達載體pET-28a中，構(gòu)建了gE基因主要抗原表位的原核表達載體。經(jīng)過篩選與鑒定，獲得了陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物通過SDS-PAGE電泳檢測，表明該融合蛋白得到了表達，且一系列的條件優(yōu)化使其表達效率得到了提高。經(jīng)Western-blotting分析，重組蛋白有良好的免疫反應(yīng)性，為單克隆抗體