偽狂犬病病毒gD基因核酸疫苗及VP22免疫增強(qiáng)效應(yīng)的研究.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies)是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一，雖然一些國(guó)家實(shí)施了根除計(jì)劃，但在絕大多數(shù)國(guó)家尤其是發(fā)展中國(guó)家，該病仍然頻繁發(fā)生，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重制約著這些國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。免疫接種仍是目前控制和預(yù)防該病的主要手段。傳統(tǒng)的豬偽狂犬病疫苗對(duì)控制疾病的發(fā)生和流行發(fā)揮了巨大作用，但無(wú)論是滅活疫苗還是弱毒疫苗均不同程度的存在免疫效果不佳或毒力返強(qiáng)等缺陷。研制更安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗一直是偽狂犬病研究的重要

2、方向。 本研究在克隆、表達(dá)豬偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)鄂A株的主要免疫原性基因gD的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了這一基因的真核表達(dá)質(zhì)粒并作為核酸疫苗，通過(guò)肌肉注射的方式免疫試驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)了動(dòng)物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平以及對(duì)病毒攻擊的保護(hù)能力，結(jié)果證實(shí)這些核酸疫苗可以有效激活試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)還研究證明偽狂犬病毒VP22對(duì)豬偽狂犬病核酸疫苗具有免疫增效作用。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.PrVEa株

3、gD基因、VP22基因的克隆分別以重組質(zhì)粒pcDD和pMD-VP22為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，在gD基因的上、下游引入HindⅢ和PstⅠ位點(diǎn)，在VP22基因的上、下游引入XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)，將擴(kuò)增的gD基因和VP22基因基因片段克隆到載體pUC119，構(gòu)建質(zhì)粒pUC-gD、pUC-VP22和pUC-gD-VP22；并將pUC-gD、pUC-VP22送上海博亞生物工程公司測(cè)序。酶切電泳鑒定，gD基因片段長(zhǎng)度約為1200bp

4、，VP22基因片段長(zhǎng)約760bp，gD-VP22基因片段長(zhǎng)約2000bp；測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增的gD基因片段為1266bp，VP22基因片段756bp，gD-VP22基因片段為2028bp。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的gD基因、VP22基因與GeneBank中公布的PrV的gD基因(AF086702)和VP22基因(AY190527)標(biāo)準(zhǔn)序列一致，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生堿基突變。 2.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用核酸內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI,酶

5、切攜帶目基因片段的pUC-gD、pUC-gD-VP22及原核表達(dá)載體pET28a(+)和真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMVTM-10，連接、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-gD、pET-gD-VP22以及真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-gD、p3XFLAG-gD-VP22。原核表達(dá)質(zhì)粒、真核表達(dá)質(zhì)粒分別酶切電泳后，分別在1300bp處和2000bp附近均出現(xiàn)了明亮的條帶，結(jié)合序列鑒定結(jié)果，可以表明目的基因已經(jīng)插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處。

6、3.gD基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-gD和pET-gD-VP22分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE結(jié)果顯示：pET-gD能夠在大腸桿菌中表達(dá)出約47kD的蛋白，pET-gD-VP22能夠在大腸桿菌中表達(dá)出約72kD的融合蛋白，Westernblot結(jié)果表明以上兩種原核表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 4.Prv-gD基因DNA疫苗的免疫保護(hù)，及VP22蛋白免疫增強(qiáng)作用將以p3XFLAG為

7、載體，構(gòu)建的gD基因真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-gD和p3XFLAG-gD-VP22，以100μg/只免疫BALB/c小鼠，間隔15天增強(qiáng)免疫一次，二免4周后采用5×105pfu的PrVEa株強(qiáng)毒攻擊，p3XFLAG-gD-VP22免疫組和p3XFLAG-gD免疫組DNA疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)率分別為87.5﹪和75﹪。 將表達(dá)gD-VP22融合蛋白的質(zhì)粒p3XFLAG-gD-VP22免疫小鼠，與非融合表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-gD進(jìn)行

8、比較，間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與VP22融合表達(dá)能顯著增強(qiáng)特異性IgG水平。通過(guò)對(duì)小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分含量分析發(fā)現(xiàn)，p3XFLAG-gD-VP22和p3XFLAG-gD免疫組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分含量均極顯著高于空載體組和空白對(duì)照組，且p3XFLAG-gD-VP22免疫組小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于p3XFLAG-gD免疫組(P＜0.05)，可見(jiàn)融合基因p3XFLAG-gD-VP22質(zhì)粒能夠誘