核酸疫苗免疫增強(qiáng)策略及其誘導(dǎo)免疫損傷的機(jī)制研究.pdf

1、核酸疫苗又稱基因疫苗、DNA 疫苗，是近年來(lái)隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型疫苗，核酸疫苗和傳統(tǒng)疫苗相比有著顯著的優(yōu)勢(shì)，免疫后能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，不僅具有預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還具有治療疾病的功效，所以治療性核酸疫苗成為近些年研究的重點(diǎn)。并迅速地從治療傳染性疾病的研究擴(kuò)展到非傳染性疾病的研究，為乙型肝炎、囊蟲(chóng)病等一系列感染性疾病的防治開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。盡管核酸疫苗得到了快速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，但其總的免疫效果還存在一定的缺陷

2、。存在某些核酸疫苗在小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中免疫效果很好，但是在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中效果不理想；有的核酸疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能起到很好的免疫保護(hù)作用，但在臨床試驗(yàn)中卻不能保護(hù)受試者抵抗病原體的侵害。如何提高核酸疫苗的免疫效果、闡述核酸疫苗的免疫機(jī)制成為核酸疫苗發(fā)展的核心問(wèn)題。
　　 鑒于核酸疫苗的免疫原性低，近年來(lái)大量的研究嘗試通過(guò)新的免疫劑型、免疫方案等多種免疫策略來(lái)改善核酸疫苗的免疫效果。本課題通過(guò)使用DNA 疫苗的免疫新劑型微針注射輔以疫苗佐劑F

3、lt3L的方法來(lái)提高乙肝DNA 疫苗的免疫效果。通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)微針注射輔以細(xì)胞因子Flt3L 聯(lián)合免疫的策略，能明顯地增強(qiáng)乙肝DNA 疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫。微針是在新型電子行業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)上衍生的新技術(shù)，通過(guò)氫氧化鉀腐蝕技術(shù)將化學(xué)聚合物、硅等焊接到1平方厘米的芯片上形成的聚合針列，其高度在50微米到200微米能夠有效穿透皮膚表層和角質(zhì)層到達(dá)活性表皮層，而皮膚尤其是活性表皮富含抗原提呈細(xì)胞，一直被認(rèn)為是高免疫活性部位，通過(guò)微針將核酸疫

4、苗靶向給藥于表皮層，可以直接作用與抗原提呈細(xì)胞從而提高免疫效果。Flt3L是近年來(lái)的被廣泛關(guān)注的一種免疫刺激分子，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞依賴性和T細(xì)胞非依賴性2種途徑的T細(xì)胞的增殖。不僅如此Flt3L 還能夠誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞DC的分泌和活化、在炎癥部位募集DC等抗原遞呈細(xì)胞。從不同免疫組合中我們比較得到微針介導(dǎo)細(xì)胞因子Flt3L能夠明顯的增強(qiáng)疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。本課題系統(tǒng)地考察了這種新的免疫方案的免疫效果，并探討了其增效的分子機(jī)制。結(jié)

5、果表明微針介導(dǎo)細(xì)胞因子Flt3L 注射能夠顯著增強(qiáng)核酸疫苗的免疫原性，增強(qiáng)疫苗免疫效果。
　　 核酸疫苗的安全性問(wèn)題也一直制約著核酸疫苗的發(fā)展，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)pcDNA3 負(fù)載的核酸疫苗誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自身免疫疾病，研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖后發(fā)現(xiàn)了腎臟的病變，進(jìn)一步深入的研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)核酸疫苗持續(xù)產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物的沉積誘發(fā)了腎小球基底膜病變。其確切機(jī)制仍不明了，此外，自然雜志上也報(bào)到了常用佐劑分子CpG 序列誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟病變

6、的現(xiàn)象。核酸疫苗免疫原性低的問(wèn)題限制了核酸疫苗的廣泛應(yīng)用。為了提高免疫效果，大量的免疫策略被嘗試。CpG 序列是常用的佐劑分子，無(wú)論是pcDNA3 載體骨架上負(fù)載的CpG序列或者是寡核苷酸CpG 都可以起到都可以起到免疫增效的作用，然而是否CpG的使用存在某些安全隱患，需要進(jìn)一步考證。多年來(lái)本課題組致力于核酸疫苗的機(jī)制研究，為了闡明核酸疫苗免疫誘發(fā)的不安全因素及其分子機(jī)制，我們以Pvax1、pcDNA3 質(zhì)粒為載體構(gòu)建了表達(dá)Annexi

7、nB1抗原的DNA 疫苗，對(duì)C57BL/6小鼠實(shí)施了3次免疫接種，通過(guò)檢測(cè)小鼠的總抗體滴度、T細(xì)胞增殖的能力、CTL活性來(lái)判斷核酸疫苗的免疫效果，研究結(jié)果表明，含有CpG 序列的pcDNA3-B1疫苗組的確誘導(dǎo)了更有效的免疫保護(hù)效果，但是在研究我們意外的發(fā)現(xiàn)pcDNA3-B1疫苗組誘發(fā)了局部黑色素丟失的免疫損傷現(xiàn)象，為了揭示這一免疫損傷的誘發(fā)因素和分子機(jī)制，本研究通過(guò)脾臟比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，尋找在免疫過(guò)程中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)，以這些顯著

8、改變的蛋白分子為橋梁尋找到核酸疫苗免疫后參與調(diào)控的信號(hào)通路，以期能闡明核酸疫苗誘發(fā)自身免疫病的分子機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果以及后續(xù)的生物信息學(xué)手段我們挑選了核酸疫苗組間差異顯著的5個(gè)蛋白，在pcDNA3-B1組顯著上調(diào)的2個(gè)蛋白和下調(diào)的3個(gè)蛋白，進(jìn)一步通過(guò)文獻(xiàn)檢索、聚類(lèi)分析以及功能分析確定了其中上調(diào)的一個(gè)蛋白growthfactor receptor bound protein 2的生理功能和pcDNA3能夠誘導(dǎo)更佳的免疫保護(hù)存在著潛

9、在的聯(lián)系，而下調(diào)蛋白中的2個(gè)蛋白proxiredoxin 1和proxiredoxin 6 屬于prdx蛋白家族成員，該家族成員的主要生理功能是在體內(nèi)降解過(guò)氧化氫、超氧離子等反應(yīng)活性氧，而體內(nèi)反應(yīng)活性氧和氧化應(yīng)激的發(fā)生有著重要的關(guān)系，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)proxiredoxin 6蛋白的下調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)反應(yīng)活性氧的富集，進(jìn)而誘發(fā)了體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生最終激發(fā)自身免疫病的產(chǎn)生。通過(guò)本研究，我們闡明了核酸疫苗免疫誘發(fā)的相關(guān)疾病的分子機(jī)制，