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文檔簡介
1、鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)引起的一種高致死率的傳染病，主要感染21日齡以內(nèi)的雛鴨，引起典型的肝炎癥狀，雛鴨死亡率高達80％以上且傳播迅速，給養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成了極大的損失。在鴨肝炎病毒感染的檢測與診斷方面，主要采用病毒分離、病毒中和試驗以及病毒核酸檢測等方法，雖各有優(yōu)點，但耗時較長，無法滿足大批量檢測的需求。因此，本研究選擇我國DHAV-1
2、流行株的結(jié)構(gòu)蛋白VP1進行了克隆和原核表達，以純化后的VP1蛋白作為檢測抗原，建立了針對鴨甲肝病毒1型血清抗體的間接ELISA方法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)快速檢測方法。
1.鴨甲肝病毒1型VP1基因的克隆與表達
本研究利用RT-PCR技術(shù)，以DHAV-1 RNA為模板，擴增出VP1基因，基因片段長714bp。構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-28a-VP1和pET-32a-VP1，并摸索其表達條件:將重組表達質(zhì)粒p
3、ET-28a-VP1和pET-32a-VP1分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株Rosetta(DE3)中，選用不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析鑒定。結(jié)果表明:VP1基因在pET-28a和pET-32a均獲得表達，表達的重組蛋白大小分別為:27 kDa、47 kDa。本研究選擇表達量較高的pET-32a-VP1原核表達質(zhì)粒，利用Ni-NTA親和層析對VP1重組蛋白進行純化，SDS-PAGE電
4、泳結(jié)果顯示純度達到95％以上，可用作檢測抗原。
2.鴨甲肝病毒1型抗體檢測間接ELISA和CLEIA方法的建立
建立的間接ELISA方法和CLEIA方法，特異性均為100％;板內(nèi)重復(fù)性實驗的變異系數(shù)分別為:1.16％-4.8％、2.27％-2.55％;板間重復(fù)性實驗的變異系數(shù)分別為:2.29％-8.6％、2.18％-4.33％;說明這兩種方法具有較高的特異性和穩(wěn)定性，且CLEIA方法靈敏度和重復(fù)性優(yōu)于間接ELISA方
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